HCMV經(jīng)TGFβ-Smad信號通路對絨毛外滋養(yǎng)細胞Smad4表達影響的體外研究.pdf

1、目的:
　　通過檢測人巨細胞病毒(HCMV)體外感染絨毛外滋養(yǎng)細胞(EVT) Smad4表達水平的變化的研究，初步探究該病毒經(jīng)TGFβ/Smad信號通路對EVT功能的影響。
　　方法:
　　1、采用復合酶梯度離心法培養(yǎng)原代EVT，通過免疫細胞化學染色檢測CK7、c-erbB-2、Vim等蛋白信號以鑒定細胞來源及純度。
　　2、培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞株MRC5以擴增HCMV AD169實驗株，并用Reed-Muenc

2、h法測其病毒半數(shù)細胞感染量TCID50。
　　3、EVT被HCMV感染后，通過免疫熒光細胞化學染色法檢測HCMVpp65抗原，判斷EVT病毒感染情況。
　　4、MTT法檢測并篩選HCMV對EVT細胞體外增殖影響的最小病毒劑量及后續(xù)試驗的最佳病毒接種量。
　　5、實驗分為正常組(EVT)和病毒組(EVT+HCMV)，HCMV接種至EVT細胞48h后，利用免疫細胞熒光技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)、Western Blot方

3、法檢測各組細胞Smad4表達的水平。
　　6、利用體外細胞侵襲實驗，研究HCMV感染EVT細胞后，對EVT體外侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1、約95％分離培養(yǎng)的原代細胞內(nèi)均可見CK7和c-erbB-2表達，Vim偶見表達，提示絨毛組織分離培養(yǎng)的細胞為高純度的EVT。
　　2、病毒HCMV AD169株測定的TCID50為10-4.21/0.1ml，即將HCMV AD169病毒稀釋104.21接種100ul可

4、使50％的細胞發(fā)生病變。
　　3、免疫熒光細胞化學染色結(jié)果顯示，EVT胞漿內(nèi)可見大量HCMVpp65抗原熒光信號。
　　4、MTT實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，HCMV感染48h后，30ul、40ul、50ul病毒液對EVT增殖抑制作用明顯（P＜0.05），各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故最佳病毒接種劑量為30ul100TCID50HCMV/120ul培養(yǎng)基。
　　5、QT-PCR結(jié)果提示，正常組和病毒組中均有

5、TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、MMP2、MMP9mRNA表達。TGF-β1 mRNA在兩組中相對表達量分別為1.000±0.050和1.246±0.045，TβRImRNA在兩組中相對表達量分別為1.001±0.052和1.317±0.051，TβRⅡ mRNA在兩組中相對表達量分別為1.001±0.052和1.296±0.114，Smad2 mRNA在兩組中相對表達量分別為1.000

6、±0.033和1.380±0.064，Smad4 mRNA在兩組中相對表達量分別為1.00±0.052和1.36±0.080， Smad7 mRNA在兩組中相對表達量分別為1.317±0.051和1.001±0.052，MMP2 mRNA在兩組中相對表達量分別為1.000±0.037和0.912±0.016，MMP9 mRNA在兩組中相對表達量分別為1.000±0.037和0.909±0.025，Smad1 mRNA在兩組中相對表達量分

7、別為1.000±0.120和1.040±0.040，Smad5 mRNA在兩組中相對表達量分別為1.010±0.130和1.100±0.160，Smad6 mRNA在兩組中相對表達量分別為1.010±0.130和0.840±0.040。與正常組比較，病毒組中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表達水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Smad7、MMP2、MMP9mRNA表達相對降低，

8、差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組EVT中Smad1、Smad5、Smad6mRNA表達無差異，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　6、免疫細胞熒光染色顯示，Smad4蛋白在正常組和病毒組EVT中均表達，其在兩組中的平均光密度(AOD)分別為0.376±0.044和0.530±0.086。與正常組比較，病毒組EVT中Smad4蛋白表達水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　7、Western Blot實

9、驗所測定的結(jié)果提示，Smad4蛋白在正常組和病毒組細胞中均表達，且在兩組中Smad4蛋白表達的灰度值(GDR)分別為0.518±0.053和0.884±0.093，與正常組比較，病毒組中Smad4蛋白表達水平增高明顯(P＜0.05)。
　　8、體外細胞侵襲實驗提示，正常組和病毒組EVT均可穿過Matrigel基質(zhì)膠，其兩組穿膜細胞數(shù)分別為（56.1±3.06）個和(45.7±2.73)個(P＜0.05)，提示HCMV抑制EVT侵襲

10、活力。
　　結(jié)論:
　　1、HCMV在體外可能通過TGF-β/Smads信號通路來抑制原代EVT細胞的增殖及其侵襲，并能使細胞中Smad4基因表達水平增高。
　　2、Smad4可能在HCMV宮內(nèi)感染導致異常妊娠的機制中起重要作用，其機制可能是HCMV損傷EVT，正性調(diào)控信號通路TGF-β族配體→受體→Smad蛋白→轉(zhuǎn)錄因子→DNA，促進Smad4表達，最終導致EVT侵潤能力不足，胚胎著床太淺，導致流產(chǎn)等異常妊娠的發(fā)生。