泛素連接酶Hrd1促進α1-抗胰蛋白酶Z突變體降解及細胞存活.pdf

1、α1抗胰蛋白酶主要由肝細胞合成，分泌到血液中，它是血清中的主要蛋白酶抑制劑，其作用主要是保護肺組織免受蛋白酶水解，尤其是中性粒細胞彈性蛋白酶的水解破壞。AAT缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率約1/2000～5000，它的典型臨床表現(xiàn)是早發(fā)性肝臟疾病和肺氣腫。AAT缺乏癥是由于編碼AAT蛋白的基因突變引起AAT分泌障礙所致，最常見的引起AAT缺乏癥的突變?yōu)閆型突變，占臨床病例的95％以上，該突變編碼的蛋白為AAT Z突變體。在前期研

2、究中我們發(fā)現(xiàn)ring-finger結(jié)構(gòu)域家族泛素連接酶gp78可以促進ATZ降解，本研究進一步觀察另一種ring-finger結(jié)構(gòu)域家族E3，Hrd1對ATZ水平的影響。
　　 目的：
　　 觀察Hrd1是否可以促進ATZ的降解，并探討其降解的機制。同時觀察Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解是否影響細胞的功能。
　　 方法：
　　 構(gòu)建ATZ、Hrd1、Hrd1的E3活性突變體Hrd1C1A等真核表達質(zhì)粒，合成si

3、RNA-Hrd1，轉(zhuǎn)染HEK 293T或HepG2細胞；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)和免疫印跡檢測mRNA及蛋白水平的變化；流式細胞檢測細胞熒光強度的變化；放線菌酮示蹤、蛋白酶體抑制實驗觀察Hrd1對ATZ表達水平影響的作用機制；免疫細胞化學(xué)和免疫熒光觀察細胞形態(tài)和蛋白定位；免疫共沉淀和蛋白片段互補實驗確定Hrd1和ATZ的相互作用；熒光顯微鏡觀察和原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法染色檢測細胞形態(tài)和凋亡情況。
　　 結(jié)果：
　　 1

4、．Hrd1表達降低細胞內(nèi)ATZ的總體水平
　　 HEK 293T細胞共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1的cDNA，設(shè)立ATZ共轉(zhuǎn)染空載體對照，24 hrs后用Triton X-100裂解液裂解細胞并離心，IB 檢測裂解液上清。與對照組相比，共表達Hrd1后ATZ在上清中的總量變化不明顯，但高分子量ATZ水平明顯降低。由于高分子量蛋白聚集體容易形成不溶性沉淀，我們推測Hrd1可能增加ATZ的可溶性并降低沉淀中ATZ水平。為了驗證這一設(shè)想，我們

5、用IB分別檢測細胞上清和沉淀中的ATZ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hrd1能明顯降低沉淀中ATZ的水平。
　　 2．下調(diào)內(nèi)源性Hrd1表達能穩(wěn)定細胞內(nèi)ATZ水平
　　 利用siRNA技術(shù)，合成siRNA-Hrd1寡聚核苷酸，并將ATZ和siRNA-Hrd1共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，同時設(shè)立陰性對照。IB結(jié)果顯示，與對照組相比，siRNA-Hrd1能使細胞內(nèi)ATZ水平增高，尤其是SDS不溶部分的ATZ水平。
　　 3．Hrd1降低

6、細胞內(nèi)ATZ水平與E3活性有關(guān)
　　 Hrd1屬于ring-finger結(jié)構(gòu)域家族E3，它的E3活性依賴其指環(huán)結(jié)構(gòu)的完整性。為了觀察細胞內(nèi)ATZ水平的降低是否與Hrd1的E3活性有關(guān)，我們分別觀察野生型Hrd1和E3活性缺失體Hrd1C1A對細胞內(nèi)ATZ水平的影響。HEK 293T細胞共轉(zhuǎn)染ATZ與Hrd1或Hrd1C1A的cDNA，24 hrs后免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，野生型Hrd1表達多的細胞，ATZ聚集減少。但Hrd1C1A

7、表達多的細胞，ATZ聚集未見減少。IB結(jié)果同樣顯示，Hrd1明顯降低沉淀中ATZ水平，而Hrd1C1A對沉淀中ATZ水平無明顯影響。上述結(jié)果提示：Hrd1降低細胞沉淀中ATZ水平是其E3活性依賴的。
　　 4．Hrd1促進ATZ的降解
　　 細胞內(nèi)蛋白水平受合成和降解兩方面因素影響，合成減少或/和降解增加均可以導(dǎo)致蛋白總體水平的降低。為了觀察Hrd1 引起的細胞內(nèi)ATZ 水平的降低是否是由于ATZ的降解增加所致，我們使用

8、了CHX (100 μg/ml) 抑制蛋白質(zhì)合成，然后觀察加入CHX后不同時間細胞內(nèi)ATZ的水平，以此來了解ATZ的降解情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hrd1 能明顯促進SDS不溶部分ATZ的降解。同時還發(fā)現(xiàn)，共表達Hrd1的細胞培養(yǎng)上清液中ATZ的分泌減少，這進一步說明，細胞內(nèi)ATZ的減少不是因為它的分泌增加，而是因為它的降解增加所致。
　　 5．Hrd1促進ATZ降解依賴其E3活性
　　 為了進一步明確Hrd1介導(dǎo) ATZ的降解是

9、否與其E3 活性有關(guān)，我們分別將HEK 293T細胞共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA，24 hrs 后在細胞的培養(yǎng)上清液中加入CHX，然后檢測各時間點細胞內(nèi)的ATZ 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hrd1C1A 能增加ATZ的可溶性，但不能促進SDS 不溶部分ATZ的降解。提示Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解與其E3活性有關(guān)。
　　 6．Hrd1 增加ATZ的泛素化
　　 細胞內(nèi)的蛋白降解主要有兩種途徑：泛素-蛋白酶體途徑 (

10、ubiquitin-proteasome pathway，UPP)和溶酶體途徑。由于Hrd1是一種ring-finger結(jié)構(gòu)域家族的E3，我們首先考慮Hrd1通過UPP途徑促進ATZ的降解。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白底物經(jīng)過UPP降解時首先被泛素化修飾，然后經(jīng)過逆向轉(zhuǎn)運到達26S的蛋白酶體，被蛋白酶體中的蛋白水解酶降解。為了明確UPP是否參與了Hrd1 介導(dǎo)的ATZ 降解，我們觀察了Hrd1 對ATZ 泛素化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有蛋白酶體抑制劑MG

11、132存在的情況下，Hrd1 可明顯降低多聚泛素化ATZ；在細胞的培養(yǎng)上清液中加入MG132，作用4 hrs 后收集細胞，共轉(zhuǎn)染ATZ和野生型Hrd1組出現(xiàn)多聚泛素化ATZ，而單獨轉(zhuǎn)染ATZ 或者共轉(zhuǎn)染ATZ與Hrd1C1A 組則沒有觀察到明顯的ATZ 泛素化。該結(jié)果提示Hrd1可以促進ATZ的泛素化，這種作用也是E3活性依賴的。
　　 7．含纈酪肽蛋白(valosin-containing protein,VCP) 參與Hrd

12、1介導(dǎo)的ATZ降解
　　 ATZ 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum，ER) 腔內(nèi)的蛋白，如果經(jīng)過UPP降解，需要從ER 逆向轉(zhuǎn)運至細胞漿，然后由26s蛋白酶體降解，即所謂的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解（ER-associated degradation，ERAD）。在ERAD過程中，VCP在蛋白底物由ER轉(zhuǎn)運至細胞漿的逆向轉(zhuǎn)運中起著重要的作用。我們進一步觀察了VCP是否也參與Hrd1 介導(dǎo)的ATZ降解。我們共轉(zhuǎn)染AT

13、Z，Hrd1和VCP的突變體VCPQQ的cDNA。結(jié)果顯示，與對照組相比，VCPQQ阻礙了Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解，提示VCP參與了Hrd1介導(dǎo)的ATZ的降解。
　　 8.溶酶體通路可能參與Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解
　　 為了觀察溶酶體通路是否參與Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解，我們共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1，觀察溶酶體膜穩(wěn)定劑氯化銨對ATZ水平的影響，發(fā)現(xiàn)加入氯化銨后，出現(xiàn)高分子量ATZ的聚集。我們同時構(gòu)建了在ATZ的信號肽前方

14、加入帶有綠色熒光蛋白 (green fluorescence protein，GFP) 標(biāo)簽的ATZ表達載體，改變ATZ在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位。將表達GFP-ATZ和Hrd1的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，設(shè)立共轉(zhuǎn)染GFP-ATZ和空載體、GFP和Hrd1及GFP和空載體的對照。24 hrs后熒光顯微鏡觀察，與對照組相比，共轉(zhuǎn)染Hrd1組GFP-ATZ綠色熒光強度明顯降低；流式細胞檢測同樣發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染Hrd1后，GFP-ATZ的熒光強度

15、降低。而在轉(zhuǎn)染GFP的對照組中，Hrd1對GFP的熒光強度沒有明顯影響，IB結(jié)果也顯示Hrd1不能降低細胞上清和沉淀中GFP的表達水平。
　　 9．Hrd1和ATZ存在相互作用
　　 前述實驗結(jié)果提示 Hrd1 可以通過UPP促進ATZ的降解。我們進一步觀察了ATZ 與Hrd1之間是否存在相互作用。共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA，免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示ATZ 與Hrd1 在細胞內(nèi)存在共定位。免疫共沉淀結(jié)果

16、提示ATZ 與Hrd1 及Hrd1C1A 均存在直接的相互作用，該結(jié)果提示ATZ 與Hrd1的相互作用與其E3 活性無關(guān)。為了進一步證實ATZ和Hrd1之間的相互作用，我們構(gòu)建載體，將ATZ和Hrd1的N端分別連上熒光素酶的C端和N端。PCA實驗觀察共表達兩種重組載體的細胞的熒光素酶活性。與對照組相比，實驗組熒光素酶活性明顯增高。該結(jié)果進一步證實Hrd1和ATZ之間存在相互作用。
　　 10.Hrd1 降低ATZ的細胞毒性

17、>　　 ATZ的聚集可以引起肝細胞毒性，我們在體外HEK 293T和HepG2的細胞模型中同樣觀察到ATZ具有細胞毒性。同時我們觀察了Hrd1 介導(dǎo)的ATZ 降解對ATZ細胞毒性的影響。免疫熒光結(jié)果顯示單獨表達ATZ的細胞或者共表達ATZ 與Hrd1C1A的細胞變圓、突起縮短、細胞核分葉、固縮、碎裂或消失；共表達Hrd1 后，細胞形態(tài)和細胞核趨于正常。統(tǒng)計分析ATZ 陽性細胞核的完整性結(jié)果顯示，Hrd1的表達有助于維持ATZ 陽性細胞