梅毒螺旋體Tp0453重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫活性研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)外膜蛋白Tp0453的優(yōu)勢(shì)表位(28-288aa)基因的重組表達(dá)體，在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行免疫原性和免疫反應(yīng)性分析，為探索Tp0453重組蛋白在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值和其生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　》椒ǎ和ㄟ^(guò)生物信息學(xué)分析，篩選并挑選Tp0453基因優(yōu)勢(shì)抗原表位，以TpNichols株基因組DNA為模板，高保真聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的片斷，將其亞克

2、隆進(jìn)原核表達(dá)載體pQE32中、構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE32/Tp0453，然后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌M15中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western-Blot進(jìn)行分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物；Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，并進(jìn)行稀釋透析復(fù)性，BCA法測(cè)定純化蛋白濃度。用純化的Tp0453重組蛋白包被微孔板，建立間接ELISA方法，檢測(cè)梅毒參比血清和臨床梅毒患者血清，同時(shí)與TPPA法進(jìn)行比較，根據(jù)重組蛋白與梅毒陰陽(yáng)性血清的反應(yīng)情況，評(píng)價(jià)重組抗原

3、在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)用純化的Tp0453重組蛋白免疫新西蘭兔，間接ELISA方法檢測(cè)免疫兔血清中Tp0453多克隆抗體的效價(jià)，對(duì)Tp0453重組蛋白的免疫原性進(jìn)行分析?！　〗Y(jié)果：軟件分析Tp0453基因的抗原表位選擇了Tp0453基因的86～849bp位堿基序列為目的表位(片段長(zhǎng)度為764bp，編碼255個(gè)氨基酸)；PCR擴(kuò)增得到以大小約為800bp的目的片斷；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定證明其中插入片斷為T(mén)p04

4、53目的基因，測(cè)序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組工程菌表達(dá)了一相對(duì)分子量(Mr)約為32KDa的目的蛋白條帶，目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式存在；經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得了純度在95％以上的重組蛋白；Western-blot檢測(cè)其能與梅毒陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)；以重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA法，檢測(cè)梅毒參考血清，其陰陽(yáng)性符合率均為100％；對(duì)TPPA法檢測(cè)的110

5、份陰陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，與TPPA法比較ELISA法的靈敏度為96.8％，特異度為100％，ELISA法與TPPA法符合率為98.2％；利用純化的Tp0453重組蛋白免疫新西蘭兔，間接ELISA法測(cè)定兔免疫血清特異性抗體效價(jià)在1：640以上。 結(jié)論：1、成功構(gòu)建了pQE32/Tp0453原核表達(dá)體，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后表達(dá)出了一相對(duì)分子量(Mr)約32KDa的重組蛋白；2、Tp0453重組蛋白具有較好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產(chǎn)生