內(nèi)毒素生物傳感器的研究.pdf

1、內(nèi)毒素(Endotoxin，ET)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，由親水性的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)共價(jià)結(jié)合疏水性的類脂A組成。是人體重要的致炎物質(zhì)。當(dāng)機(jī)體遭受燒傷、創(chuàng)傷、感染及血液透析時(shí)，非常容易因感染發(fā)展為內(nèi)毒素血癥，其病死率超過30％。在某種程度上說，造成病人的最后死亡是因?yàn)槿狈σ环N可靠、靈敏和定量的檢測(cè)方法。用于內(nèi)毒素檢測(cè)的方法已有較多報(bào)道，但還遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前臨床檢驗(yàn)和食品、制藥、環(huán)境等領(lǐng)域的需要

2、，因?yàn)檫@些方法存在不同程度的問題，如操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏度低、定量性差、自動(dòng)化程度低；或需要標(biāo)記、裝置復(fù)雜且昂貴等。研究一種靈敏度高、簡(jiǎn)便、定量性好且低廉的檢測(cè)方法仍是一件很有價(jià)值的工作。 壓電石英晶體生物傳感器是一種高靈敏度的傳感裝置，能響應(yīng)晶體表面的質(zhì)量負(fù)載以及液體粘度、密度、電導(dǎo)率以及介電常數(shù)等物理參數(shù)的變化。而且裝置低廉、操作簡(jiǎn)單、易與實(shí)現(xiàn)與計(jì)算機(jī)接口，具備理想的生物傳感器的許多特點(diǎn)。壓電石英晶體根據(jù)其響應(yīng)機(jī)理，分為質(zhì)量

3、效應(yīng)型和非質(zhì)量效應(yīng)型。由于質(zhì)量效應(yīng)型傳感器具有很高的質(zhì)量靈敏度，也被稱為石英晶體微天平，非常適合生物大分子的測(cè)定。質(zhì)量效應(yīng)型壓電傳感器通常在晶體表面固定化一層載體，通過載體固定能與待測(cè)生物物質(zhì)選擇性結(jié)合物質(zhì)，響應(yīng)待測(cè)生物物質(zhì)通過特異性結(jié)合反應(yīng)引起微小質(zhì)量變化，這種方法無需任何標(biāo)記物，直接響應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量，方法很簡(jiǎn)單。非質(zhì)量效應(yīng)型傳感器通過被測(cè)物中加入一些促使混合液物理性質(zhì)發(fā)生變化的生物物質(zhì)，通過測(cè)量這些物理參數(shù)變化引起的晶體諧振頻率變化間

4、接測(cè)量待測(cè)物的濃度。這一方法也不需要標(biāo)記，而且還省去了固定化步驟，方法更簡(jiǎn)單且易于實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)。本論文擬利用上述兩種原理，研制成兩種定量、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)內(nèi)毒素的檢測(cè)方法。具體內(nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面： (1)采用一維三層結(jié)構(gòu)模型，推導(dǎo)出石英晶體傳感器在同時(shí)存在質(zhì)量負(fù)載效應(yīng)和粘性耦合效應(yīng)下的力學(xué)模型和等效電路模型。結(jié)果與Martin采用連續(xù)機(jī)電模型得到的結(jié)果相似，為理解液相壓電石英晶體傳感器的振蕩提供了基礎(chǔ)。 (2)設(shè)計(jì)

5、新的石英晶體振蕩電路，提高了晶體振蕩頻率的穩(wěn)定性，從而提高了測(cè)量信號(hào)的信噪比，并且該電路能在氣液兩相中穩(wěn)定工作；利用復(fù)雜可編程邏輯器件(CPLD)構(gòu)建具有能與計(jì)算機(jī)進(jìn)行串行通信功能的頻率計(jì)數(shù)器，克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法采用商用頻率計(jì)數(shù)器存在體積大、成本高以及集成化低等缺陷；測(cè)量軟件采用虛擬儀器編程軟件(LABVIEWTM)編制，軟件的主要功能包括：數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)顯示與保存以及數(shù)據(jù)分析和處理等，克服傳統(tǒng)方法花費(fèi)大量時(shí)間進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入和處理的缺點(diǎn)，實(shí)

6、現(xiàn)了測(cè)量的智能化。 (3)在石英晶體電極表面通過固定3-ATPES偶聯(lián)戊二醛，從而將PMB固定到晶體表面。主要考察了PMB與內(nèi)毒素的親和吸附性能以及傳感器用于內(nèi)毒素的檢測(cè)的選擇性、靈敏度、檢測(cè)范圍、重現(xiàn)性和再生能力等技術(shù)指標(biāo)。結(jié)果表明利用該方法研制的傳感器的檢測(cè)范圍為5.0～20μg/ml；靈敏度約8Hz/(μg/ml)。 (4)采用分子自組裝成膜技術(shù)，在石英晶體金電極表面自組裝一帶羧基的巰基自組裝單層膜(分別采用巰基丙

7、酸、11-巰基-11烷酸和16-巰基-16烷酸)，共價(jià)鍵合固定PMB。主要考察了影響巰基自組裝的因素、PMB的最佳固定化條件以及傳感器用于內(nèi)毒素的檢測(cè)的選擇性、靈敏度、檢測(cè)范圍、重現(xiàn)性和再生能力等技術(shù)指標(biāo)。同時(shí)還考察了不同長(zhǎng)度碳鏈的自組裝膜對(duì)傳感器靈敏度的影響。結(jié)果表明利用該方法研制的傳感器的檢測(cè)范圍2.0～20μg/ml；隨自組裝分子碳鏈長(zhǎng)度增加，傳感器的靈敏度有所提高，其中16-巰基-16烷酸自組裝固定法的傳感器靈敏度到達(dá)12.4H

8、z/(μg/ml)。 (5)為了進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度和降低傳感器檢測(cè)下限。提出了一種質(zhì)量放大方法一自組裝納米金顆粒法。重點(diǎn)研究該了自組裝納米金顆粒的條件，PMB最佳固定化條件以及傳感器靈敏度和檢測(cè)下限改善情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該傳感器的檢測(cè)范圍為0.4～10μg/ml；靈敏度為42.1Hz/(μg/ml) (6)根據(jù)內(nèi)毒素與鱟試劑混合發(fā)生凝膠反應(yīng)引起液體流變學(xué)性質(zhì)(粘度與密度)變化，而石英晶體能靈敏地響應(yīng)這種變化。開發(fā)出