豬傳染性胃腸炎病毒SC-Y株M基因序列分析、原核表達研究及真核表達載體構建.pdf

1、本研究以TGEVSC-Y株的毒種為材料擴增克隆M基因，并對其序列進行生物信息學分析；同時利用獲得的M基因進行原核表達載體構建、表達及真核表達載體構建研究。主要研究結果如下： Ⅰ、參照GenBank中登錄號AJ271965的TGEV基因序列，利用自行設計的一對引物，以ST細胞增殖培養(yǎng)的SC-Y株TGEV為材料，采用RT-PCR技術擴增出M基因，TA克隆構建獲得其重組質(zhì)粒pMD18-TrM。序列分析顯示SC-Y株與GenBank中登

2、錄的TS、TFI、Purdue、Purdue-115、PUR46-MAD、96-133、HN2002、FS772/70、TO14株M基因核苷酸序列同源性達94％以上，氨基酸序列同源性達91％以上，表明不同毒株M基因保守性較高。M蛋白基因系統(tǒng)進化及其氨基酸同源性分析顯示SC-Y株與美國Purdue株親緣關系較近，同時研究發(fā)現(xiàn)我國TS、TFI株分別與韓國HN2002株、英國FS772/70株親緣關系較近，而我國SC-Y、TS、TFI三株之間

3、親緣關系則較遠，這從一定程度上說明我國TGEV可能為外國輸入性。M蛋白氨基酸二級結構綜合參數(shù)分析、信號肽及跨膜區(qū)預測顯示，SC-Y株M前體蛋白存在有四個跨膜區(qū)(氨基酸殘基位于1-16，53-75，86-104，113-135)，其中1-16位為信號肽序列；成熟M蛋白(去除信號肽)為三個跨膜區(qū)，其N端位于病毒膜外區(qū)，而C端位于病毒膜內(nèi)區(qū)。SC-Y株成熟M蛋白高級結構預測顯示其功能結構域在N端主要集中于氨基酸殘基8-21，該區(qū)域與M蛋白的生

4、物學功能關系密切；預測綜合分析顯示可形成有效抗原表位的區(qū)域在N端氨基酸殘基4-30或其附近。 Ⅱ、以pMD18-TrM為材料，擴增、TA克隆構建獲得M蛋白去信號肽序列基因的重組質(zhì)粒pMD18-T△M。運用DNA技術，將pMD18-TrM、pMD18-T△M中M蛋白基因及其去信號肽序列基因分別轉(zhuǎn)移定向克隆到pET32a(+)中，獲得重組原核表達載體pET32a(+)-rM、pET-32a(+)-△M。構建成功后分別轉(zhuǎn)化高效表達菌株

5、E.coliBL21(DE3)進行表達研究。SDS-PAGE電泳檢測結果顯示，原核重組表達載體pET32a(+)-rM未成功表達出預期目的融合蛋白Trx-M；原核重組表達載體pET-32a(+)-△M表達出預期融合目的蛋白Trx-△M，其表達量有待進一步研究；WesternBlotting檢測結果顯示，表達的去信號肽目的融合蛋白Trx-△M具有特異的生物學免疫原性。 Ⅲ、根據(jù)真核表達載體pEGFP-C1多克隆位點(MCS)特點設