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文檔簡介
1、骨質疏松的定義為骨量降低和骨結構惡化,這些可以導致骨組織脆性增加及病理性骨折增多。在骨的微環(huán)境中成骨細胞帶來的骨形成及破骨細胞帶來的骨吸收式骨質疏松形成的病理過程,該過程涉及到多種內源性(如基因和激素)和外源性(如營養(yǎng)和功能鍛煉)因素來共同調節(jié)骨組織的重構。盡管骨質疏松的危險因素可以通過生活狀態(tài)(飲食和合理的功能鍛煉),藥物(鈣劑,維生素D,激素替代藥物)治療來防范,但是,骨質疏松骨折帶來的殘疾和死亡仍然嚴重的影響老年人口尤其是65歲以
2、上老年人生命質量的。目前老齡骨質疏松癥的分子調控機制尚不完全清楚,因此我們的研究排除了性激素及糖皮質激素的影響而主要關注著男性老齡骨質疏松癥的病理機制和過程。
之前的研究顯示在骨重建過程中骨形成的缺陷使老齡骨質疏松癥的主要病理機制。骨髓中的骨髓基質干細胞(Bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是成人骨重建中成骨前體細胞的主要來源,因此了解調控老齡骨質疏松患者BMSCs成骨分化的調控機制并強化其
3、成骨分化能力是進一步探索骨質疏松癥診斷和治療的關鍵。
整合素α和β跨膜結構可以觸發(fā)及調節(jié)細胞的粘附及分化過程,其是細胞同周圍大分子基質環(huán)境相互作用的重要調節(jié)因子。之前的研究顯示整合素αV,α5β1,αvβ3和β3/β5參與了成骨細胞同周圍大分子基質環(huán)境相互作用從而影響了成骨細胞的功能及骨重建的過程。在成骨分化過程中如果使用整合素α5或β1抗體干預可以使成骨細胞的礦化減少大約20%和45%,相應的αVβ3抗體干預可以減少大概65
4、%,α2β1抗體干預可以減少近95%。此外,在人BMSCs成骨分化中整合素α2β1,α5β1及αVβ3可以活化細胞內信號通道及隨后的堿性磷酸酶和骨鈣素表達。整合素在老齡骨質疏松中的分布特點及調控機制尚未明確,因此我們研究了老齡骨質疏松癥患者BMSCs上整合素的表達特點和作用。
【目的】
1、老齡骨疏患者 BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及成骨能力檢測;2、老齡骨質疏松患者BMSCs整合素表達特點的研究;3、構建和包裝帶有
5、Integrinα2慢病毒載體,包裝成慢病毒后轉染上述 BMSCs;4、觀察轉染后生物學功能、成骨能力及相關下游通道改變情況,明確Integrinα2調控老齡骨質疏松患者BMSCs成骨分化分子機制。
【方法】
1、利用分層離心技術對捐獻者骨髓細胞進行分離,培養(yǎng)后擴增,流式細胞技術對培養(yǎng)細胞的表面分子進行測定,誘導分化技術驗證其向骨、脂肪分化的功能,MTT及CFU-F測定細胞增殖能力;2、利用RT-PCR方法檢測骨疏及
6、正常intergrinβ1,β3,α2,α5,αv表達情況差異,成骨誘導過程中β1,α2的變化同成骨相關基因(ALP/RUNX2/OSTERIX)變化相關性;3采用 DNA連接技術、酶切鑒定技術等構建intergrinα2質粒,包裝慢病毒后轉染BMSCs,免疫熒光鑒定轉染結果,優(yōu)化轉染條件以達到最大轉染率;4、利用 RT-PCR、MTT、流式細胞技術、細胞分化技術、免疫熒光技術、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色技術對轉染后的BMSCs的生物學
7、特性和成骨分化能力進行檢測;檢測轉染后成骨誘導條件下ERK-p,Pi3K-p,P38、JNK相關信號通道同成骨活性的相關變化,并進一步檢驗及變化通道的上下游變化,通過干預上游信號驗證關鍵通道。
【結果】
1.老齡骨疏患者BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及成骨能力檢測
采用密度梯度離心法分離了志愿者捐獻的骨髓,15cm培養(yǎng)板貼壁培養(yǎng)后擴增,流式細胞技術檢測培養(yǎng)細胞表達細胞CD135、CD105,不表達CD34、C
8、D45,CFU-F實驗證明其具有單細胞增殖能力,分化實驗表明其能夠向骨和脂肪組織分化,這些都表明老齡骨疏同非骨疏人間充質干細胞具有相同的細胞表型,均具有多向分化潛能,但骨疏患者的細胞增殖及成骨分化能力較弱。
2.老齡骨質疏松患者BMSCs整合素表達特點
我們檢測發(fā)現老齡骨疏患者BMSCsβ1,α2明顯降低、誘導后3、7、14天β1,α2增高亦低于非骨質疏松者,且α2這種變化同成骨相關基因(ALP/RUNX2/OSTE
9、RIX)變化關系更緊密,這些結果提示:α2在成骨分化中有重要作用,老齡骨疏患者的α2缺陷是成骨能力降低的重要原因。
3.成功構建帶有α2的質粒,轉染并穩(wěn)定表達含上述基因的老齡骨疏患者BMSCsα2在成骨分化中有重要作用,因此上調老齡骨疏患者BMSCs上的α2可能促進
BMSCs向成骨分化。構建帶有α2基因的慢病毒,轉染BMSCs發(fā)現α2表達增高,優(yōu)化上述轉染條件,使轉染效率達到最高。
4.體內外實驗證明轉染
10、α2基因的老齡骨疏患者BMSCs的ERK基因表達上調,從而使成骨分化能力增強
為檢測骨質疏松患者BMSC整合素α2高表達對成骨分化的影響我們將轉染和未轉染細胞鋪板,培養(yǎng)一周后加入成骨誘導劑,發(fā)現同野生型對比轉染后 RUNX2及Osterix表達明顯增加,ALP活性平均增加43.6%(3 days),58.03%(7 days)和60.42%(14 days),同樣的茜素紅染色證明轉染整合素α2可以增強骨疏BMSC的礦化能力,定
11、量分析發(fā)現礦化能力增加了40.83%(14 days)和54.79%(21 days)。結果提示骨質疏松患者BMSC整合素α2高表達促進了細胞增殖及成骨分化。
為了明確骨質疏松患者 BMSC整合素α2高表達對成骨及增殖的影響的作用機制,我們檢測了整合素下游信號通路ERK/AKT/JNK/P38的磷酸化狀態(tài),發(fā)現成骨誘導分化后轉染組ERK在成骨誘導后30 min快速活化。轉染后RUNX2、ALP活性和茜素紅染色增強可以被ERK通
12、道阻滯劑PD98059所抑制。
【結論】
本研究發(fā)現老齡骨疏hBMSCs上Integrinα2的異常下調可以導致其增殖及成骨分化能力的降低。進一步的機制研究提示老齡骨疏患者BMSCs成骨及增殖缺陷可以通過高表達α2基因得到修復,Integrinα2活化了下游的ERK通道,從而使目的基因Runx2高表達來促進細胞的成骨分化。總而言之,我們的研究結果提示 Integrinα2/ERK/Runx2信號通路在老齡骨疏發(fā)病中具
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