肝星狀細胞特異性啟動子調(diào)控的真核表達載體的構(gòu)建與鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、【目的】：
　　構(gòu)建含有靶向活化肝星狀細胞特異性啟動子的質(zhì)粒,并于體外檢測其表達情況。
　　【方法】：
　?、倮镁酆厦告準椒磻?yīng)從PMIR-luciferase質(zhì)粒中擴增得到目的基因——表達螢火蟲熒光素酶基因片段即luciferease基因以及MCS多克隆位點+PloyA尾巴片段,通過雙酶切將其連接克隆至含有α平滑肌肌動蛋白啟動子(αSMA啟動子)的Psmp8質(zhì)粒載體中,構(gòu)建Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒

2、,并進行酶切鑒定、基因測序證實。②利用膠原酶、鏈酶蛋白酶、DNA酶等灌注消化小鼠肝組織后,密度梯度離心法提取肝星狀細胞(HSCs);HSC培養(yǎng)傳代自行活化后,進行針對αSMA的Westernblot及免疫熒光檢測。③Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒及海腎熒光素酶質(zhì)粒按20:1比例混合后分別轉(zhuǎn)染HSCs、小鼠肝細胞系A(chǔ)ML12、小鼠庫弗細胞系RAW264.7作為實驗組,peGFP質(zhì)粒及海腎熒光素質(zhì)粒按20:1比例混合后分別轉(zhuǎn)染

3、HSC、AML12、RAW264.7作為對照組,48h后雙熒光素酶報告基因檢測法檢測兩質(zhì)粒表達情況。
　　【結(jié)果】：
　?、貾smp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒經(jīng)酶切及基因測序鑒定正確,成功構(gòu)建了Psmp8+Luciferase質(zhì)粒。②Westernblot及免疫熒光檢測示所提取細胞培養(yǎng)傳代后可表達αSMA。③雙熒光素酶報告基因檢測顯示Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒中螢火蟲熒光素酶基因可在活化HSCs中

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