阻斷酸敏感離子通道1a對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨保護作用的細胞分子機制研究.pdf

1、機體pH值的穩(wěn)定對于細胞正常功能的維持至關(guān)重要。在生理環(huán)境下,細胞通過H+的多種轉(zhuǎn)運途徑保持細胞外和細胞內(nèi)的pH值穩(wěn)定在7.3--7.0左右。在一些病理條件如炎癥、缺血和腫瘤發(fā)生過程中,由于組織無氧糖酵解產(chǎn)生乳酸和ATP水解的H+積聚,導致體液pH值急劇下降。研究表明低pH值是類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)關(guān)節(jié)部位發(fā)生炎癥反應的主要特征之一,在嚴重的RA疾病中,pH值甚至降低至5.5。近期研究表明胞外pH

2、值的改變對關(guān)節(jié)軟骨細胞功能和代謝有著重要的影響,RA的關(guān)節(jié)軟骨損傷與關(guān)節(jié)局部組織的pH值降低密切相關(guān)。然而,對于局部組織酸化是通過何種途徑影響關(guān)節(jié)軟骨細胞并導致軟骨損傷的機制目前仍有待進一步研究。
　　酸敏感離子通道(acid-sesing ion channels,ASICs)是一類由胞外酸化后被激活的陽離子通道,開放的通道對Na+、Ca2+具有通透性,進而引起細胞一系列生理病理變化。目前為止,已克隆了由4個基因編碼的7個ASI

3、Cs亞基:ASIC1a、ASIClb、ASIClb2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。ASICs廣泛分布于哺乳動物的外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。越來越多的研究證實ASICs在組織酸化(如慢性炎癥和腦缺血)等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。其中Ca2+通透性ASIC1a在缺血性腦損傷過程中發(fā)揮的作用引起了人們的強烈關(guān)注。而RA病程中由于炎癥導致關(guān)節(jié)局部組織酸化與缺血性腦損傷導致的酸中毒具有相似的病理特征,因此,本課題組建立

4、與人類RA發(fā)病機制和病理特點極為相似的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant Arthritis,AA)模型,以觀察ASICs在RA病程中的作用并探討其可能機制。本課題組前期研究結(jié)果首先證實了SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨中存在ASIC1a、ASIC2a和ASIC3 mRNA及其蛋白的表達,并且在AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中ASIC1a、ASIC2a和ASIC3的表達均明顯高于正常組;進一步研究發(fā)現(xiàn)非甾體類抗炎藥阿司匹林對AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護作用與抑制ASICs

5、表達有關(guān);體內(nèi)研究證實,ASICs非特異性阻滯劑Amiloride對AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨具有保護作用,這種保護作用機制與抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的II型膠原(type II collagen,COII)和蛋白多糖(aggrecan,Acan)丟失有關(guān)。
　　正常生理狀況下,軟骨細胞通過合成II型膠原和蛋白多糖等基質(zhì)以及維持MMPs與TIMPs間平衡保持關(guān)節(jié)軟骨的完整功能。AA大鼠

6、關(guān)節(jié)軟骨損傷與軟骨細胞對軟骨基質(zhì)的合成減少及MMPs(matrix metalloproteinas,MMPs)與TIMPs(tissueinhibitor of metall-oproteinas,TIMPs)之間的代謝平衡破壞有關(guān)。研究表明胞外酸化通過影響軟骨細胞ECM、MMPs、TIMPs的代謝平衡從而導致關(guān)節(jié)軟骨損傷。那么,這種損傷是否與軟骨細胞中的酸感受器ASICs有關(guān)呢，阻斷ASICs對AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護作用是否通過影響

7、軟骨細胞ECM、MMPs、TIMPs的代謝平衡來實現(xiàn)的呢，其作用機制又是什么。
　　為此,進行了下列三部分研究:
　　1 ASIC1a對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞Ca2+濃度的影響
　　本研究中,分別采用RT-PCR、熒光染色法和Western blot法檢測大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASIC1a mRNA和蛋白的表達,并進一步檢測ASIC1a對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。研究結(jié)果顯示,大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞存在ASIC1a mRNA

8、和蛋白的高表達;胞外酸化刺激可顯著增加大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)Ca2+的濃度,ASIC1a特異性阻滯劑PcTx-1可顯著減少大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)Ca2+的濃度,并可減輕由于鈣離子超載導致的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)上清中LDH活性增高。但在無鈣離子培養(yǎng)基中,胞外酸化刺激對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)Ca2+濃度無明顯的影響。以上研究結(jié)果提示,阻斷ASIC1a可抑制大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)鈣離子濃度,并且通過抑制大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)Ca2+濃度超載保護關(guān)節(jié)軟骨細胞。

9、r>　　2 ASIC1a對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)代謝的影響
　　本研究中,主要觀察ASIC1a對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)代謝的影響。首先,通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將ASIC1a siRNA序列瞬時轉(zhuǎn)染到大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中,建立大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASIC1a表達沉默模型,并使用對二甲基亞甲藍分光法檢測大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)上清中GAG的含量,氯胺T法檢測培養(yǎng)上清中HYP的含量,ELISA法檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-

10、2的含量。結(jié)果顯示,本研究中設(shè)計并合成的ASIC1a siRNA序列可成功建立ASIC1a表達沉默模型,胞外酸化刺激可通過激活ASIC1a調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞對GAG、HYP、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的代謝。進一步分析發(fā)現(xiàn),ASIC1a對MMP-2、MMP-9代謝的調(diào)控水平遠遠低于對GAG、HYP、TIMP-1和TIMP-2代謝的調(diào)控。ASIC1a表達沉默可阻斷胞外酸化激活ASIC1a導致的GAG、HYP、TI

11、MP-1和TIMP-2代謝水平下降,而對MMP-2和MMP-9的影響相對較小。以上研究結(jié)果提示,阻斷ASIC1a可通過不同程度調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞GAG、HYP、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的代謝水平導致ECM合成增加、降解減少,從而保護AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨。
　　3 MAPK信號通路在ASIC1a調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)代謝中機制的研究
　　本文前期研究結(jié)果顯示ASIC1a調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的基質(zhì)代謝,

12、但其具體的分子機制仍不清楚。本部分試驗主要研究MAPK信號通路在ASIC1a調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)代謝中的機制。研究結(jié)果顯示,ASIC1a激活可介導大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞磷酸化p38 MAPK和磷酸化ERK1/2蛋白表達,并激活核轉(zhuǎn)錄因子c-jun和c-fos蛋白的表達;鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制磷酸化p38 MAPK和磷酸化ERK1/2蛋白表達,并抑制核轉(zhuǎn)錄因子c-jun和c-fos的表達;p38 MAPK抑制劑可抑制核轉(zhuǎn)錄因子c

13、-jun蛋白表達,ERK1/2阻滯劑可抑制核轉(zhuǎn)錄因子c-fos蛋白表達;MAPK信號通路可調(diào)控大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞GAG、HYP、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的mRNA和蛋白表達水平。本部分試驗結(jié)果提示胞外酸化激活ASIC1a通過激活Ca2+依賴的ERK/c-fos信號通路調(diào)控GAG、HYP、TIMP-1和TIMP-2的代謝和Ca2+依賴的p38 MAPK/c-jun信號通路調(diào)控MMP-2和MMP-9的代謝,阻斷ASI