西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白鑒定及功能研究.pdf

1、昆蟲嗅覺系統(tǒng)在其覓食、尋偶、選擇產(chǎn)卵場(chǎng)所等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，參與此過程的蛋白主要有氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensoryproteins，CSPs)、氣味受體（olfactory receptors，ORs）、氣味降解酶(odorant degrading enzymes，ODEs)以及感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane

2、proteins，SNMPs)等。西花薊馬Frankliniella occidentalis（Pergande），又名苜蓿薊馬，隸屬纓翅目(Thysanoptera)薊馬科(Thripidae)花薊馬屬Frankliniella，目前已成為世界性的危險(xiǎn)性入侵害蟲。本研究通過開展西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因克隆、時(shí)空表達(dá)、蛋白表達(dá)純化、熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合以及免疫定位研究，為西花薊馬更多嗅覺相關(guān)蛋白基因的發(fā)掘奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為闡明西花薊馬行為反應(yīng)本質(zhì)

3、、與環(huán)境間的化學(xué)通訊提供理論依據(jù)。
　　1.西花薊馬感器掃描電鏡觀察
　　西花薊馬觸角中的感器主要有毛形感器(sensilla trichodea)、刺形感器(sensilla chaetica)、錐形感器(sensilla basiconica)、乳狀感器(mamillary sensilla);足上主要有毛形感器、刺形感器、錐形感器、吸耳球形感器（sensilla ear washing buob-shaped）、乳突感

4、器(mamillary sensilla)、鐘形感器(sensilla campaniform)、B(o)hm氏鬃毛(B(o)hm bristle);復(fù)眼上只有1種刺形感器。
　　2.西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因分子克隆
　　成功克隆獲得4個(gè)西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因cDNA序列全長(zhǎng)和1個(gè)基因cDNA序列片段，分別命名為FoccCSP1、FoccCSP2、FoccOBP1、FoccOBP2、FoccOR1，GenBank登錄號(hào)分別

5、為KM527949、KM035415、KM527948、KM527950、KM527951。 FoccCSP1、FoccCSP2、FoccOBP1、FoccOR1全長(zhǎng)cDNA序列分別為597bp、521bp、660bp、1645bp，開放閱讀框分別為288bp、387bp、450bp、1374bp，分別編碼95、128、149、457個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)成熟蛋白分子量分別為11.377、14.51、16.388、51.19kDa，等電點(diǎn)分別為

6、4.72、5.41、7.46、5.08，F(xiàn)occCSP2和FoccOBP1的N-端分別含有19、22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。獲得FoccOBP2的cDNA序列880bp，通過生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)具有完整的開放閱讀框，ORF長(zhǎng)591bp，編碼196個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)該成熟蛋白分子量為23.66kDa，等電點(diǎn)為7.41。
　　3.西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因表達(dá)譜分析
　　各基因在西花薊馬不同發(fā)育期的表達(dá)豐度差異較大，F(xiàn)occCSP1在羽化id

7、雌蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為2齡若蟲;FoccCSP2在1齡若蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為羽化1天的雌蟲;FoccOBP1在2齡若蟲和1齡若蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為羽化1天的雌、雄成蟲;FoccOBP2在2齡若蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為羽化1天的雌、雄成蟲;FoccOR1在羽化1d雌蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為2齡若蟲、羽化1d的雄蟲。各基因均在觸角中的表達(dá)量最高，F(xiàn)occCSP1、FoccCSP2和FoccOR1均在觸角中的相

8、對(duì)表達(dá)量最高，其次為足;FoccOBP1基本上是在觸角中特異性表達(dá)，在足、頭、胸等部位該基因表達(dá)甚微;FoccOBP2在觸角中表達(dá)量最高，在足部該基因也有少量表達(dá)。
　　4.西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白的原核表達(dá)與純化
　　成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)/FoccCSP1、pET-30a(+)/CSP2、pET-30a(+)/OR1，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及Ni柱純化，成功獲得不帶融合標(biāo)簽的目的蛋白FoccCSP1和FoccCSP2

9、，分子量分別約為11 kDa和15 kDa，采用BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定了純化后目的蛋白的濃度，F(xiàn)occCSP1蛋白濃度為1.455 mg/mL，F(xiàn)occCSP2蛋白濃度為1.013 mg/mL，滿足后續(xù)試驗(yàn)的需要。
　　5.西花薊馬化學(xué)感受蛋白FoccCSP2結(jié)合特性
　　選用19種化學(xué)氣味分子作為配基測(cè)試了西花薊馬化學(xué)感受蛋白FoccCSP2的與各氣味分子的結(jié)合能力，以1-NPN作為熒光報(bào)告子，結(jié)合能力最強(qiáng)的是茴香醛，[

10、IC50]值為11.3944μmol/L，與FoccCSP2的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合常數(shù)KD為10.5047;其次為香葉醇，[IC50]值為15.3463μmol/L，KD為14.1480。相對(duì)結(jié)合能力中等有甲基水楊酸、煙酸乙酯、異煙酸甲酯、苯甲醛、乙基苯、香茅醇、香茅醛、正壬醛、芳樟醇，[IC50]從35.2426μmol/L逐漸上升到85.6408μmol/L，KD也從32.4906增加到78.9534。其余氣味物質(zhì)的相對(duì)結(jié)合能力較弱。
　

11、　6.西花薊馬化學(xué)感受蛋白FoccCSP1免疫電鏡定位
　　通過免疫新西蘭大白兔制備了FoccCSP1蛋白抗體，透射電鏡觀察顯示，該蛋白抗體具有較強(qiáng)的免疫特異性，能與該蛋白很好的結(jié)合，并確切的反應(yīng)出該蛋白的分布。膠體金顆粒在西花薊馬觸角、感器、頭、足等部位淋巴液中都明顯標(biāo)記，可見該蛋白基因組織分布廣泛，與該基因基于qRT-PCR表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果吻合。推測(cè)該基因除了參與環(huán)境氣味物質(zhì)的識(shí)別、運(yùn)輸外，還可能參與感受機(jī)械刺激、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育或