黑麥屬種質資源分子生物學研究.pdf

1、黑麥屬(SecaleL.)是小麥的三級基因源，其中蘊藏著豐富的遺傳變異，是改良小麥產量、品質、抗病性和抗逆性的重要基因資源。為合理有效地利用該基因資源，有必要綜合應用各種技術，進一步闡明黑麥屬遺傳多樣性及系統進化關系。本研究應用SDS-PAGE、SSR、5SrRNA等生化及分子標記技術，對黑麥屬種質資源的遺傳多樣性及物種間系統進化關系進行了研究。同時，利用普通小麥LMW-GS引物序列對黑麥屬LMW-GS類似基因進行了分離克隆，并通過序列

2、比較分析其與小麥、大麥和黑麥各種貯藏蛋白基因間的關系。主要研究結果如下： 1.黑麥屬72份材料SDS-PAGE分析結果表明，黑麥屬貯藏蛋白與普通小麥不同，可明顯區(qū)分為4種類型：HMW、γ-75k、ω和γ-40k。在72份材料中共檢測到54種貯藏蛋白帶型，每份材料分離出7-11條帶，多數9-10條。在HMW區(qū)檢測到6種亞基，21種不同組合。γ-40k區(qū)多為3條帶，其它區(qū)域均以2條帶最為普遍。各區(qū)域均存在一定變異，但以HMW-GS和

3、γ-40區(qū)變異最大。供試材料平均遺傳相似系數(GS)為0.748，變幅為0.450-1.000。S.sylvestre種內的GS值(0.970)較高，S.cereale種內的GS值(0.797)較低。S.sylvestre與S.cereale的種間GS值(0.633)最低，且與其它2個種的種間GS值(＜0.700)也均較低。S.vavilovii與S.cereale的種間GS值高達0.785。栽培黑麥不同洲內及洲際材料間的遺傳相似系數均

4、較接近。聚類分析不能將72份材料完全區(qū)分開來，S.sylvestre與其它物種差異明顯，S.vavilovii與S.cereale具有較近的遺傳關系，而其它物種的聚類較為混雜。這些結果說明，SDS-PAGE分析可以在一定程度上反映黑麥屬物種間的親緣關系，但不能有效地揭示不同地理來源栽培黑麥間的遺傳關系。 2.應用SSR標記分析黑麥屬遺傳多樣性及親緣關系結果表明，24個黑麥微衛(wèi)星引物(SCM)在30份黑麥屬不同物種材料中平均多態(tài)性

5、信息含量(PIC=0.604)比在47份不同地理來源栽培黑麥中的(0.471)高；黑麥屬物種平均遺傳相似系數(GS=0.633)低于栽培黑麥(0.773)。S.sylvestre種內的平均GS值最大，而S.strictum種內的最小。S.cereale和S.vavilovii的種間平均GS值最大，而S.sylvestre和S.cereale的最小。來源于亞洲、歐洲、北美洲和南美洲的GS值沒有明顯差異。聚類分析表明，S.sylvestre

6、與其它物種差別最大，可以明顯區(qū)分，而S.vavilovii和S.cereale遺傳距離最小，聚為同一大類。S.strictum種內存在很大的遺傳分化。這些結果說明，由SSR標記獲得的聚類圖能夠真實地反映黑麥屬種的水平上的系統親緣關系，但不能很有效地揭示不同地理來源的栽培黑麥材料的馴化過程。 3.從黑麥屬4個種10個亞種共23份材料中總共獲得129個5SrRNA基因序列，將這些序列分別劃歸入兩種長度單元：480bp的長單元(10n

7、gR1)和460bp的短單元(shortR1)。依據5SrDNA序列差異不能有效區(qū)分黑麥屬各物種。利用BLAST搜索到分別與longR1和shortR1一致性高的兩套5SrDNA單元序列：1)longR1(Secale)+longP1(Agropyron；Kengyilia)+longJ1(Thinopyrum)；2)shortR1(Secale)+longS1(Pseudoroegneria；Kengyilia)+shortJl(Th

8、inopyrum)+shortV1(Dasypyrum)。每套序列分別用最大似然法進行系統進化分析結果表明，黑麥屬5SrDNA單元以無分子鐘(non-clock)模式分化。從最大似然樹上可以看出longR1單元遵循HKY替換模式，而shortR1單元遵循HKY+G替換模型。longR1與longPl的進化關系最近，其次為longJ1；而shortR1與longS1的關系最近，其次為shortJl，與shortV1的關系相對較遠。貝葉斯統

9、計分析也獲得了一致的結果。 4.利用根據已知LMW-GS序列設計的一對引物對黑麥屬各物種基因組DNA進行擴增，結果在3份S.sylvestre中獲得了目的片段。對S.sylvestre材料R955/90的擴增產物進行回收、克隆、測序，共得到3個基因序列(Ssy1，Ssy2和Ssy3)，Genbank登錄號分別為AY829368、AY829369和AY829370。Ssy1，Ssy2和Ssy3基因編碼的氨基酸序列均包含4個區(qū)段：高

10、度保守的20個氨基酸殘基組成的信號肽區(qū)域、由13個氨基酸殘基組成的N-端保守區(qū)、由可重復短肽組成的高度變異的重復區(qū)和C-端保守區(qū)。由于N-端保守區(qū)第一個氨基酸均為Met，所以Ssy1，Ssy2和Ssy3均為LMW-m型。系統進化分析表明，所獲得的3個LMW谷蛋白類似基因與小麥的LMW-GS基因和大麥的Bhordein基因具較高的一致性。與小麥Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點LMW-GS序列同源關系比較分析也取得了一致的結果。