Hsp72保護(hù)XIAP抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、急性腎功能衰竭是臨床常見的嚴(yán)重腎臟疾病，腎缺血／再灌注損傷是急性腎功能衰竭的主要病因之一。缺血／再灌注所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡在急性腎功能衰竭的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵的作用。細(xì)胞凋亡不僅是缺血后腎功能喪失的主要原因，也與缺血性心臟、腦和肝損傷密切相關(guān)，而抑制細(xì)胞凋亡可明顯改善臟器功能。 Caspase家族是一組結(jié)構(gòu)特征相似的半胱氨酸蛋白酶，細(xì)胞凋亡的發(fā)生與Caspase家族成員的活化密切相關(guān)。凋亡抑制蛋白(IAPs，inhibi

2、tor of apoptosisprotein)家族是唯一已知的內(nèi)源性凋亡抑制因子，最早在桿狀病毒中發(fā)現(xiàn)。XIAP是IAPs家族中最強(qiáng)的Caspase抑制劑，其N-末端有3個BIR(baculovirus IAPrepeat)的結(jié)構(gòu)域：BIRl、BIR2、BIR3，羧基末端有RING指結(jié)構(gòu)域(RING fingermotif)組成；BIR結(jié)構(gòu)域是大約含有70個氨基酸的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域，研究顯示，BIR結(jié)構(gòu)域?qū)τ赬IAP發(fā)揮凋亡抑制作用是必不

3、可少的，其中BIR1、BIR2之間的連接區(qū)域可以與Caspase-3、-7相結(jié)合，而BIR3則和Caspase-9相結(jié)合而發(fā)揮凋亡抑制作用，其羧基末端有1個RING結(jié)構(gòu)域，具有E3泛素連接酶活性，能催化自身及靶蛋白通過泛素化而降解。大量體內(nèi)、體外研究顯示高表達(dá)XIAP可以明顯抑制各種原因引起的凋亡，因此，在過度凋亡引起的各種疾病中，XIAP可能成為一個新的治療靶點。 Smac／Diablo和HtrA2／Omi是兩種新近發(fā)現(xiàn)的位于

4、線粒體內(nèi)外膜間隙的促凋亡蛋白質(zhì)，是XIAP內(nèi)源性拮抗因子。DIABLO(direct IAP binding protein withlow PI)和Omi是分別是人Smac(second mitochondria-derived activator of caspase)和HtrA2(high temperature requirement A2)的鼠類同源物。研究表明，Srnac/Diablo和HtrA2/Omi都擁有與高度保守的I

5、AP的結(jié)合區(qū)域。在凋亡信號刺激下，Smac/Diablo、HtrA2/Omi由線粒體釋放至胞漿中，與XIAP的BIR2、BIR3相互結(jié)合，進(jìn)而消除XIAP對Caspase-3、-7、-9的抑制作用，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。此外，HtrA2/Omi還具有絲氨酸蛋白酶活性，可直接降解XIAP，使XIAP蛋白水平下調(diào)，導(dǎo)致XIAP抑制Caspase的作用減弱，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 熱休克蛋白72(Heat shock protein 72

6、，Hsp72)是HSPs家族中最易誘導(dǎo)和最重要的成員之一，也是在缺血性臟器損傷中研究較為廣泛的一種。在正常狀態(tài)下，作為分子伴侶能幫助新合成蛋白質(zhì)的折疊、移位；在應(yīng)激狀態(tài)下，Hsp72表達(dá)明顯增加，可使變性蛋白質(zhì)復(fù)性或促進(jìn)嚴(yán)重?fù)p傷蛋白質(zhì)的降解，因而能保護(hù)細(xì)胞抵抗各種損傷。Hsp72也是一種抗凋亡的蛋白。Hsp72可從不同途徑、不同水平抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示，Hsp72能在細(xì)胞色素C釋放、apoptosome復(fù)合物形成、casp

7、ase酶啟動等多個水平抑制caspase依賴性凋亡信號通路；還能與線粒體釋放的AIF結(jié)合，阻止AIF進(jìn)入細(xì)胞核，抑制caspase非依賴性凋亡信號通路。 但是，Hsp72能否通過抑制Smac/DIABLO、HtrA2/Omi由線粒體釋放至胞漿，并抑制其與XIAP相互結(jié)合，防止HtrA2/Omi對XIAP的降解，保護(hù)XIAP的凋亡抑制作用，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用?目前尚未見類似報道。因此，我們的研究目的是探討Hsp72以XAIP

8、為治療靶點，發(fā)揮抗腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。在體內(nèi)實驗中，我們用GGA特異性誘導(dǎo)tsp72高表達(dá)，觀察大鼠缺血/再灌注損傷時，Hsp72對凋亡的發(fā)生情況及XIAP表達(dá)的影響；在體外實驗中，我們應(yīng)用腎小管上皮細(xì)胞ATP耗竭/再恢復(fù)的模型(缺血/再灌注腎損傷的體外模型)，并采用含有Hsp72RNA的腺病毒感染細(xì)胞，使其高表達(dá)Hsp72，從而進(jìn)一步探討Hsp72抑制Smac/DIABLO、HtrA2/Omi釋放，保護(hù)XIAP，抑制細(xì)胞凋亡

9、的機(jī)制。 第一部 分體內(nèi)實驗材料和方法 12只sD(Sprague-Dawley，SD)大鼠，夾閉左腎蒂45min后，松開血管夾并切除右腎，建立大鼠腎臟缺血／再灌注損傷模型。同時設(shè)6只大鼠作為假手術(shù)組，打開腹腔，分離腎血管周圍組織，但不鉗夾血管。在模型建立后第12h和24h各處死6只模型組大鼠，在第24h處死6只假手術(shù)組大鼠，留取冰凍組織、冰凍切片標(biāo)本、病理和組織化學(xué)標(biāo)本，處死前心臟穿刺取血標(biāo)本，留取血清測血肌酐和尿素氮

10、。腎組織石蠟切片行PAS染色，觀察和評估腎組織腎小管損傷程度。腎小管損傷是指腎小管壞死、刷狀緣的脫落、管型形成和小管擴(kuò)張等，損傷程度采用損傷腎小管所占百分比評分法進(jìn)行評估。TUNEL檢測腎臟缺血／再灌注損傷時凋亡的發(fā)生情況，免疫組化檢測cleaved caspase-3的表達(dá)，western-blot檢測XIAP的蛋白水平。用GGA特異性誘導(dǎo)Hsp72高表達(dá)后，觀察其對腎功能、腎小管損傷、TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)及XIAP蛋白表達(dá)水平的影

11、響。 結(jié)果 1、腎臟缺血／再灌注時，可引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡，腎功能受損；同時 XIAP蛋白水平降低，cleaved caspase-3活性增加，提示XIAP凋亡抑制作用減 弱，caspase依賴的凋亡信號通路活化。 2、特異性高表達(dá)Hsp72，可通過穩(wěn)定XIAP蛋白水平，抑制腎臟缺血／再灌注所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減輕腎小管損傷，改善腎功能。 第二部分體外實驗 HK-2細(xì)胞融合后，

12、吸除含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞三次，換用含5 mM氰化鈉和5 mM去氧葡萄糖的無糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5％CO<,2>條件下孵育90 min，以阻斷細(xì)胞內(nèi)的ATP生成，引起細(xì)胞ATP耗竭；隨后換用含10 mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液，使細(xì)胞ATP耗竭后再恢復(fù)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用Hoechst檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生；采用間接免疫熒光檢測Smac／DIABLO的定位分布；提取胞漿蛋白，western-blot檢測中Sm

13、ac、HtrA2的含量；提取總蛋白檢測xIAP、procaspase-3的蛋白水平；腺病毒感染HK-2細(xì)胞，誘導(dǎo)野生型Hsp72高表達(dá)，應(yīng)用western-blot觀察其對Smac、HtrA2、XIAP和procaspase-3蛋白水平的影響，聯(lián)合免疫沉淀(Co-immunoprecipitation．Co-IP)分析HSP72與Smac、XIAP之間的相互作用。 結(jié)果 1、HK-2細(xì)胞ATP耗竭／再恢復(fù)時，Smac、H

14、trA2從線粒體釋放至胞漿，XIAP蛋白水平降低，XIAP的凋亡抑制作用減弱，Caspase-3活化。 2、HK-2細(xì)胞特異性高表達(dá)Hsp72，可通過抑制細(xì)胞ATP耗竭／再恢復(fù)所致的線粒體蛋白Smac、HtrA2釋放至胞漿,而且Hsp72和Smac、XIAP相互作用明顯增強(qiáng)，XIAP被降解減少，從而穩(wěn)定XIAP蛋白水平，保護(hù)其抑制細(xì)胞凋亡的作用。 結(jié)論 我們的研究證實，在腎臟缺血／再灌注損傷時，Hsp72可通過抑