超臨界流體技術(shù)制備絲素-聚乳酸復(fù)合組織工程支架的研究.pdf

1、組織工程支架的構(gòu)建是組織工程的核心問題之一,其涉及生物材料的選擇和支架的制備工藝。絲素/聚乳酸復(fù)合材料具有良好的細胞親和性、生物相容性、機械強度和可調(diào)生物降解速率等一系列特點,在組織工程領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用和研究;超臨界二氧化碳技術(shù)在組織多孔支架的制備方面也具有獨特的優(yōu)勢。
　　本文以碳酸氫銨為致孔劑,采用超臨界二氧化碳相分離法分別制備了聚乳酸及絲素/聚乳酸復(fù)合支架,并研究其生物相容性、載蛋白類大分子的釋放情況及拓撲結(jié)構(gòu)對細胞的影響

2、。
　　首先,以碳酸氫銨為致孔劑,采用超臨界二氧化碳相分離法制備了聚乳酸多孔支架。先通過Minitab實驗設(shè)計,主要考察了聚乳酸粘度、碳酸氫銨尺寸和碳酸氫銨/聚乳酸比例對聚乳酸多孔支架孔隙率和壓縮強度的影響。實驗結(jié)果表明,二氯甲烷作溶劑,在聚乳酸粘度為3.5 dl/g,碳酸氫銨顆粒尺寸為300~600μm,碳酸氫銨/聚乳酸比例為20的條件下,制得的聚乳酸多孔支架孔隙率高(>95％)、壓縮強度好(>100 kPa)。在優(yōu)化后的條件下

3、,考察超臨界二氧化碳相分離操作條件(溫度、壓力和時間)及不同溶劑對多孔支架內(nèi)部形貌的影響,結(jié)果表明,隨著溫度(35~45℃)的升高,聚合物-溶劑之間的相互作用增強,支架趨于形成不均一的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);隨著壓力(10~20 MPa)的增大,二氧化碳的密度和溶劑力增強,聚乳酸支架孔隙率和孔洞尺寸增大;隨著相分離時間(0.5~1.5 h)的延長,聚合物貧相生長時間增加,聚乳酸支架孔洞尺寸增大。聚乳酸溶于二氯甲烷,經(jīng)相分離后制得的支架具有大孔結(jié)構(gòu),孔

4、洞尺寸梯度分布,壁面光滑;聚乳酸溶于二氧六環(huán),經(jīng)相分離后獲得具有納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的支架;聚乳酸溶于二氯甲烷/二氧六環(huán)混合溶劑,經(jīng)相分離后制備的支架具有大孔、小孔共存,孔洞相互貫通的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。頂空氣相色譜檢測支架中二氯甲烷和二氧六環(huán)殘留量分別為12 ppm和17 ppm,遠低于USP467藥典規(guī)定的上限(600 ppm和380 ppm),體現(xiàn)了超臨界流體技術(shù)制備多孔支架所具有的有機溶劑殘留量低的特點。紅外光譜、X-射線衍射和差熱分析表明,

5、聚乳酸經(jīng)超臨界二氧化碳處理后,化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團、晶型、玻璃化溫度及熔點等均未見明顯變化。聚乳酸負載溶菌酶經(jīng)超臨界二氧化碳處理后,活性仍然可以保持在95%以上。
　　其次,以碳酸氫銨為致孔劑,采用超臨界二氧化碳相分離法制備了絲素/聚乳酸多孔支架。先采用超臨界流體強制分散法制備絲素納米顆粒,考察噴嘴尺寸、壓力、溶液濃度、溶液流速、二氧化碳流速等因素對絲素納米粒徑的影響。實驗結(jié)果表明,將0.5%(w/v)的絲素六氟異丙醇溶液,在壓力10

6、 MPa、溫度35℃和二氧化碳流速1500 L/h的條件下,以0.5 mL/min的流速經(jīng)噴嘴(150μm)進入高壓釜,制得的絲素粒徑分散性和球形度好,平均粒徑為296.5 nm,納米顆粒表面電負性強。絲素經(jīng)超臨界處理后,化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團沒有明顯變化,結(jié)晶度和玻璃化溫度升高,分解溫度略有降低。絲素納米顆粒載溶菌酶試驗表明,隨著投藥量的增大,載藥量增大,包封率降低,最大載藥量和包封率分別為12.7%和74.4%。經(jīng)絲素負載后溶菌酶具有一定

7、的緩釋性能,且酶活力得到保持。將絲素納米顆粒和聚乳酸復(fù)合后經(jīng)超臨界相分離制備了絲素/聚乳酸復(fù)合支架,隨著絲素納米顆粒含量的增加,復(fù)合支架孔隙率由94.5%降到91.8%,壓縮強度由123.5 kPa增到176.6 kPa;復(fù)合支架中溶菌酶的緩釋性能得到進一步提高,650 h累計釋放率為54.4%,且藥物釋放濃度和絲素納米粒的載藥量線性相關(guān)。
　　然后,對絲素/聚乳酸復(fù)合支架進行了生物相容性評價。細胞增殖試驗表明,復(fù)合支架材料浸提液

8、對細胞生長無抑制作用,細胞形態(tài)良好、貼壁正常,細胞的相對增殖率大于80%,屬于1級水平。全身急性毒性試驗表明,小鼠經(jīng)尾靜脈注射支架浸提液后,生長狀況良好,體重增加明顯,表明復(fù)合支架材料為無毒材料。細胞溶血試驗表明,復(fù)合支架材料溶血率均低于1.5%,具有良好的血液相容性。動態(tài)凝血時間試驗表明,在每個時間點,復(fù)合支架材料的吸光值高于對照組,說明復(fù)合支架材料組具有良好的抗凝血性能。
　　最后,研究了絲素/聚乳酸復(fù)合支架及聚乳酸支架納米拓

9、撲結(jié)構(gòu)對細胞的影響。結(jié)果表明,絲素納米顆粒的加入不僅增加了復(fù)合支架的表面粗糙度,而且改善了聚乳酸支架的細胞親和性。隨著絲素納米顆粒的增加,絲素/聚乳酸復(fù)合支架對蛋白的吸附、細胞的粘附以及支架粘附細胞的蛋白分泌量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,且與聚乳酸支架具有顯著性差異(p<0.01)。聚乳酸支架的納米纖維結(jié)構(gòu)比表面積大,比大孔結(jié)構(gòu)的光滑壁面更有利于蛋白的吸附和小鼠成纖維細胞的粘附;聚乳酸支架的多孔結(jié)構(gòu)孔徑較大,有利于蛋白的傳遞和細胞的穿透,