綿羊Myostatin基因敲除及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、Myostatin(MSTN)又稱為GDF-8，屬TGF-β超家族，是一種主要在動物骨骼肌中特異性表達(dá)的肌肉生長負(fù)調(diào)控因子。Myostatin基因超量表達(dá)可以導(dǎo)致動物肌肉萎縮，而其突變則使動物產(chǎn)生雙肌現(xiàn)象。Myostatin基因敲除小鼠的體重比對照組提高30％，肌肉量增加一倍，但對生存和繁育并未產(chǎn)生負(fù)面影響。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Myostatin基因自發(fā)突變雙肌牛的存在，但人為敲除Myostatin基因的畜禽尚未成功建立。本試驗(yàn)選用產(chǎn)仔率較高的中國

2、小尾寒羊?yàn)檠芯繉ο?，從小尾寒羊基因組中擴(kuò)增出4.6kb和0.8kbMyostatin基因片段，分別作為打靶載體的5’同源長臂和3’同源短臂，以載體pGEM-3Zf(-)為骨架，以Neo和EGFP為標(biāo)記基因和報(bào)告基因，構(gòu)建了帶有雙篩選標(biāo)記的無啟動子且無PolyA信號的綿羊Myostaitn基因打靶載體p3Zf-MSTN，并以小尾寒羊胎羊?yàn)椴牧戏蛛x并純化了小尾寒羊原代骨骼肌成肌細(xì)胞，為通過基因打靶獲得Myostatin基因第三外顯子部分序列

3、缺失的綿羊體細(xì)胞和利用體細(xì)胞克隆建立Myostatin敲除的綿羊模型提供了條件，為進(jìn)一步在細(xì)胞和動物水平驗(yàn)證Myostatin缺失與畜禽肌肉超常發(fā)育的關(guān)系和探索利用Myostatin基因敲除改良畜禽生長性能的可能性奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)在打靶載體標(biāo)記基因和報(bào)告基因的兩端引入了loxP序列，以期利用Cre/loxP系統(tǒng)去除篩選基因和報(bào)告基因，以排除篩選基因和報(bào)告基因?qū)yostatin功能研究的影響，也為生產(chǎn)能夠安全食用的綿羊新品種奠定基礎(chǔ)。

4、 相比于Myostatin的基因與蛋白結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能而言，對Myostatin基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控機(jī)制了解甚少。盡管綿羊Myostatin的cDNA序列已經(jīng)克隆，但其5’調(diào)控區(qū)序列仍然未知。為了更好地了解綿羊Myostatin基因5’調(diào)控區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能，深入研究綿羊Myostatin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本試驗(yàn)選用中國小尾寒羊?yàn)椴牧?，克隆了包?.211kbMyostatin啟動子(Pro)的1.517kb基因片段(GenBa

5、nk登錄號為AY918121)，并對一些重要的調(diào)控元件進(jìn)行了鑒定。序列比較分析表明，綿羊1.211kb(注：以下簡稱1.2kb)Myostatin啟動子(AY918121)與山羊(AY827576)、牛(AJ438578)、豬(AY527153)、人(AX058992)和鼠(AY204900)啟動子的同源性分別為98.1％、95.8％、86.9％、80.2％和67.7％。MatInspecter分析表明1.2kb的綿羊Myostatin

6、啟動子區(qū)存在3個TATAbox、1個CAATbox和8個E-box。另外，也發(fā)現(xiàn)存在Octamer、API、Gri-1B、MEF2、MTBF、GRE和PRE等重要調(diào)控元件。對豬、牛、山羊和綿羊Myostatin基因5’啟動子區(qū)一些重要調(diào)控基元的比較表明，各種調(diào)控元件在數(shù)量和位置上既存在保守性，也存在變異性。 為了進(jìn)一步鑒定以上調(diào)控元件，以EGFP為報(bào)告基因，構(gòu)建了各種長度的野生型MSTNProW-EGFP載體和一些調(diào)控元件突變后

7、的突變型MSTNProM-EGFP載體，通過轉(zhuǎn)染C2C12小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系，對各種情況下EGFP的瞬時或穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)行了熒光強(qiáng)度定量分析。結(jié)果表明不含任何啟動子的pEGFP-N1(4.1kb)陰性對照質(zhì)粒載體幾乎沒有EGFP表達(dá)，而0.3～1.2kb的綿羊Myostatin啟動子都能不同程度地驅(qū)動EGFP在C2C12細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，其中1.2kb片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性最高。然而將綿羊1.2kbMSTNProW-EGFP載體轉(zhuǎn)染綿羊成纖

8、維細(xì)胞后并未觀察到EGFP的表達(dá)，這一結(jié)果再次驗(yàn)證了Myostatin轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的肌肉特異性。綿羊1.2kb的Myostatin啟動子區(qū)多個E-box(E)元件的存在暗示了肌肉特異性調(diào)控元件E-box的重要性以及MRFs轉(zhuǎn)錄因子家族(如MyoD等)對綿羊Myostatin轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能性。突變分析表明E3、E4、E5和E7，尤其是E3、E5和E7，對綿羊1.2kbMyostatin啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性具有重要影響。E3、E4和E5非常鄰

9、近的序列位置暗示了它們可能是共同作用于相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，以族的形式維持DNA-蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性。E3和E5同時突變或E3、E5和E7同時突變并未比單獨(dú)突變其中一個元件表現(xiàn)出顯著差異。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染綿羊1.2kbMSTNProW-EGFP載體的C2C12細(xì)胞中EGFP表達(dá)的研究表明，細(xì)胞生長密度的增加可以反饋性抑制Myostatin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而且Myostatin在C2C12分化狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量比成肌狀態(tài)時顯著升高。然而，對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1

10、.2kbMSTNProE357M-EGFP(E3、E5和E7同時突變)載體的C2C12細(xì)胞，EGFP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量并未表現(xiàn)出分化和生長狀態(tài)時的差別。這一結(jié)果暗示了MyoD可能是通過E-box引起Myostatin在C2C12分化和生長狀態(tài)時轉(zhuǎn)錄和表達(dá)差異的原因，因?yàn)镸yoD是參與成肌分化的一個主要因素。突變分析表明靠近綿羊Myostatin啟動子序列第三個TATA-box上游的MEF2元件(MEF2-1)對綿羊1.2kbMyostati

11、n啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性具有顯著的增強(qiáng)效應(yīng)，而利用MatInspecter分析的另外一個MEF2元件(MEF2-2)沒有產(chǎn)生預(yù)期的效應(yīng)。另外，在我們的試驗(yàn)中還鑒定了對綿羊Myostatin啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性具有顯著影響的另外一個肌肉特異性調(diào)控元件MTBF。GRE調(diào)控元件的突變使綿羊1.2kbMyostatin啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性顯著降低，一定劑量的糖皮質(zhì)激素(地塞米松)可以顯著增加綿羊1.2kb野生型Myostatin啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性

12、，而對GRE元件突變后的Myostatin啟動子影響不顯著，暗示了糖皮質(zhì)激素可能通過作用于GRE元件促進(jìn)綿羊Myostatin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而抑制肌肉的發(fā)育。糖皮質(zhì)激素受體抑制劑RU-486能夠顯著抑制糖皮質(zhì)激素對綿羊1.2kb野生型Myostatin啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的促進(jìn)效應(yīng)，意味著糖皮質(zhì)激素和GRE調(diào)控元件的作用是通過糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的。PRE元件的突變或孕激素的添加均使綿羊1.2kbMyostatin啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性明顯