微量透析評(píng)估豬心臟死亡供肝缺血損傷程度的研究.pdf

1、前言：
　　器官移植是治療終末期疾病的有效手段。然而近年來(lái)，器官緊缺已成為制約我國(guó)器官移植發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。因此盡快建立既符合中國(guó)國(guó)情，又被國(guó)際社會(huì)廣泛認(rèn)可的人體器官捐獻(xiàn)體系已成為我國(guó)器官移植界當(dāng)前面臨的首要問(wèn)題。心臟死亡供者(Donor after Cardiac Death, DCD)器官移植是目前我國(guó)乃至國(guó)際上最有前景的器官來(lái)源途徑，但由于該類器官熱缺血時(shí)間較長(zhǎng)，從一定程度上會(huì)影響移植物功能及預(yù)后。因此，基于我國(guó)臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上

2、，如何準(zhǔn)確評(píng)估DCD器官的熱缺血損傷，最大程度的開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)有供體資源，提高移植手術(shù)數(shù)量，是器官移植工作者要解決的重大課題。
　　移植物在器官保存過(guò)程中，都會(huì)因缺血缺氧造成一定程度的細(xì)胞損傷，從而影響移植后移植物的功能。并且隨著冷熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，移植物的功能受損程度隨之升高。因此，出于安全性原則考慮，對(duì)于冷熱缺血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的供器官，移植醫(yī)生多會(huì)盡量避免使用。但是，目前尚無(wú)準(zhǔn)確、公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估DCD器官缺血損傷情況。因此，對(duì)于處在邊

3、緣狀態(tài)的供器官，臨床工作中尚無(wú)法對(duì)其移植預(yù)后進(jìn)行正確的評(píng)估而加以有效利用。另一方面，移植物術(shù)后功能狀態(tài)受多種因素影響，除了冷熱缺血時(shí)間的長(zhǎng)短，還包括移植物本身質(zhì)量等，這些因素綜合作用、相互影響，最后集中體現(xiàn)在移植物的微環(huán)境代謝變化上，直接影響移植物功能狀態(tài)。因此，若能對(duì)移植物在手術(shù)前后的微環(huán)境代謝變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可有效判斷預(yù)后，并對(duì)移植物加以最大限度的利用。
　　微量透析技術(shù)是一種可以對(duì)活體進(jìn)行動(dòng)態(tài)微量取樣的新技術(shù)。其主要原理為

4、:將一種具有透析作用的、半透膜性質(zhì)的微細(xì)探針置于供器官內(nèi)，利用一部非常精細(xì)的注射泵，推送交換液至探針處，以達(dá)到與組織內(nèi)欲取出測(cè)量的低分子量或高分子量物質(zhì)，進(jìn)行透析交換，再將透析液做進(jìn)一步的分析。該技術(shù)具有活體取樣，動(dòng)態(tài)觀察，定量分析，采樣量小，組織損傷輕等特點(diǎn)。利用微量透析技術(shù)對(duì)移植物微環(huán)境代謝進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可以達(dá)到以下幾個(gè)目的:一、可以有效評(píng)估與冷、熱缺血損傷相關(guān)的參考指標(biāo)，考量其與供器官功能障礙的的相關(guān)性，并根據(jù)大樣本研究，總結(jié)出相關(guān)

5、指標(biāo)的參考范圍;二、對(duì)冷、熱缺血時(shí)間較長(zhǎng)的器官或其他邊緣供體，可根據(jù)內(nèi)環(huán)境變化，預(yù)測(cè)移植效果，并有及時(shí)采取對(duì)癥治療和預(yù)防性治療;三、有助于研究缺血再灌注損傷和原發(fā)性移植物功能障礙的機(jī)制;四、提高供器官的利用率和移植效果，為更多患者施行手術(shù)。
　　目的：
　　本研究以豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，制作DCD供肝模型，利用微量透析技術(shù)監(jiān)測(cè)不同生化指標(biāo)（葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油）在不同冷、熱缺血時(shí)間段的變化，同時(shí)評(píng)估冷熱缺血時(shí)間段供肝組織病理學(xué)

6、變化，從而分別篩選出與DCD供肝熱冷缺血及冷缺血損傷程度相關(guān)的指標(biāo)。
　　方法：
　　1、建立豬DCD供肝模型
　　小型豬全麻后，經(jīng)口氣管插管接呼吸機(jī)輔助通氣，監(jiān)測(cè)血壓變化，序貫行撤機(jī)拔管，即窒息法建立豬DCD供肝模型。
　　2、微量透析技術(shù)的應(yīng)用
　　(1)探針插入取樣
　　微量透析所用導(dǎo)管(直徑0.6mm)是半透膜制成的雙層同心管(CMA61 LiverMD Catheter，CMA Microd

7、ialysis，Stockholm, Sweden)，插入肝臟實(shí)質(zhì)，將探針用4/0線固定。導(dǎo)管與纖維注射泵相連（CMA106 Microinfusion Pump:CMAMicrodialysis AB，Stockholm, Sweden），持續(xù)灌注交換液（交換液成分:Na+147mmol/L，K+4mmol/L，Ca2+2.3 mmol/L;滲透壓濃度290mOsm/kg; pH6;交換液購(gòu)自CMA Microdialysis AB，

8、Stockholm，Sweden)。交換液依次通過(guò)內(nèi)膜與透析膜，分子在細(xì)胞外液與灌注液之間進(jìn)行擴(kuò)散。
　　(2)程序設(shè)置
　　初始6分鐘灌注速度15μl/min，旨在排出系統(tǒng)內(nèi)氣泡，防止破壞組織細(xì)胞，之后灌注速度控制在熱缺血2μl/min。冷缺血時(shí)灌注速度0.3μl/min。
　　3、不同冷、熱缺血時(shí)段的確定和需檢測(cè)的代謝產(chǎn)物及組織病理學(xué)改變
　　(1)取樣時(shí)間
　　熱缺血時(shí)間5分鐘，10分鐘，15分鐘，2

9、0分鐘，25分鐘，30分鐘各取樣一次，同一時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)病理取樣一次。
　　冷缺血時(shí)間1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)……24小時(shí)，各取樣一次，同一時(shí)間點(diǎn)組織學(xué)病理取樣一次。
　　(2)檢測(cè)項(xiàng)目
　　乳酸、丙酮酸、葡萄糖、甘油、乳酸與丙酮酸比值。
　　(3)樣本檢測(cè)
　　采用CMA600型微量透析儀對(duì)所得樣本進(jìn)行分析。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　ROC曲線、Spearman相關(guān)性分析:結(jié)合組織病理學(xué)改變，總結(jié)

10、出冷熱缺血時(shí)間相關(guān)的代謝產(chǎn)物。
　　結(jié)果：
　　1、隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，供肝組織形態(tài)學(xué)損傷進(jìn)行性加重;葡萄糖水平隨熱缺血時(shí)間延長(zhǎng)而升高，丙酮酸水平在熱缺血早期升高，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)變化不明顯，甘油水平隨熱缺血時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸升高;乳酸水平在熱缺血20分鐘后明顯升高;乳酸與丙酮酸比值在熱缺血20分鐘后明顯升高。乳酸的表達(dá)量以及乳酸/丙酮酸的比值，隨熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，各時(shí)間點(diǎn)的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均為P＜0.001）。

11、　　2、隨著冷缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄糖及乳酸隨冷保存時(shí)間延長(zhǎng)而下降，而甘油三酯及丙酮酸則增高，各時(shí)間點(diǎn)的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均為P＜0.001）。乳酸/丙酮酸的比值下降，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.33)。
　　結(jié)論：
　　乳酸水平及乳酸/丙酮酸比值與熱缺血時(shí)間呈明顯正相關(guān)，有望作為移植物熱缺血損傷的預(yù)測(cè)指標(biāo)。葡萄糖、甘油三酯、乳酸和丙酮酸與肝冷缺血時(shí)間存在相關(guān)性，葡萄糖及乳酸與缺血存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，甘油三酯及丙酮酸與冷缺血時(shí)間呈正相