TSP50在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義初步研究.pdf

1、目的:
　　癌/睪丸抗原(cancer/testis antigen，CTA)為腫瘤抗原的一大類。因其高頻率且較為嚴(yán)格的在腫瘤組織中表達(dá)，并能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤的特異性體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，CTA在腫瘤免疫治療中極具發(fā)展?jié)摿?，逐漸成為腫瘤免疫治療中的研究熱點(diǎn)。
　　睪丸特異性蛋白酶50(testes-specific protease50，TSP50)基因是利用從人乳腺癌細(xì)胞中分離出來的低甲基化DNA片段，通過甲基化敏感的代

2、表性差異分析技術(shù)，從人睪丸cDNA文庫中篩選發(fā)現(xiàn)的一種CTA基因。它編碼一種蘇氨酸蛋白酶，與常見的絲氨酸蛋白酶同源，但其酶催化活性中心三聯(lián)體中的絲氨酸被蘇氨酸所替換。生理?xiàng)l件下，TSP50特異性表達(dá)于睪丸的精母細(xì)胞中，病理狀態(tài)下高水平表達(dá)于絕大部分(>90％)乳腺癌組織中。降低TSP50基因表達(dá)水平能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞對多柔比星的敏感性。其中的分子機(jī)制可能與NF-κB的激活有關(guān)。TSP50基因接

3、受p53基因的負(fù)調(diào)節(jié)，而堿性成纖維細(xì)胞生長因子能夠通過ERK/Sp1通路下調(diào)TSP50的表達(dá)。因此，上述結(jié)果提示TSP50基因應(yīng)該是一個癌基因。通過文獻(xiàn)檢索，目前尚未見在除乳腺癌以外的其它人體惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)TSP50異常表達(dá)的報(bào)道。
　　早期研究認(rèn)為，TSP50基因的表達(dá)與其啟動子的甲基化狀態(tài)密切相關(guān)。乳腺、肺、腎等正常組織中的TSP50基因啟動子處于甲基化狀態(tài)，此時基因不表達(dá)；相反，睪丸與乳腺癌中的TSP50基因處于去甲基化狀態(tài)

4、，此時基因表達(dá)。與正常結(jié)直腸組織相比，結(jié)直腸癌普遍存在基因整體的低甲基化狀態(tài)，并且目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌表達(dá)多種CTA。因此，我們推測TSP50也很可能在結(jié)直腸癌中表達(dá)。
　　迄今，TSP50基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其臨床意義尚不清楚。本研究目的在于通過檢測TSP50在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，分析其與各臨床病理特征間的關(guān)系；以結(jié)直腸正常組織與腺瘤作為對照，評價TSP50對結(jié)直腸癌的診斷價值；并基于腫瘤分期(早、晚期)評價其對結(jié)直腸

5、癌患者的預(yù)后價值。此外，我們還檢測了p53蛋白與癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，以探討其與TSP50表達(dá)水平之間的關(guān)系。由于CEA是一個已經(jīng)確立的結(jié)直腸癌預(yù)后因子，我們同時分析了CEA與該組結(jié)直腸癌患者預(yù)后間的關(guān)系，以驗(yàn)證該組患者作為預(yù)后研究的可信度。
　　方法:
　　1.提取SW480、SW620、LS174T、HT-29、LoVo、CaCo-2與HCT116等結(jié)直腸

6、癌細(xì)胞株的總RNA與蛋白質(zhì)，分別利用RT-PCR與Western blot檢測TSP50的mRNA與蛋白質(zhì)在上述結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　2.利用Western blot分析比較TSP50在8例結(jié)直腸癌患者的癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)差異。
　　3.收集我院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織95例，腺瘤組織20例，正常結(jié)直腸組織20例，制成組織芯片，并采用免疫組織化學(xué)染色顯示TSP50、p53及CEA在組織中的表達(dá)情況，觀察它們在細(xì)

7、胞中的表達(dá)部位(細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞膜)。根據(jù)染色的強(qiáng)弱和/或染色細(xì)胞的數(shù)量，將TSP50、CEA及p53的表達(dá)水平分為：-、+、++、+++四個等級。為便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將“-、+”合并為低表達(dá)組，“++、+++”合并為高表達(dá)組。
　　4.利用卡方檢驗(yàn)評價臨床病理特征(患者年齡與性別，腫瘤的部位、大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期與分級等)與TSP50、p53或CEA表達(dá)水平的關(guān)系。利用等級資料的相關(guān)性分析評價TSP50表達(dá)水平與p

8、53或CEA表達(dá)水平的關(guān)系。
　　5.利用受者作用特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲線評價TSP50在結(jié)直腸癌與結(jié)直腸正常組織或腺瘤中的鑒別診斷價值，并計(jì)算敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值以及約登指數(shù)(敏感性＋特異性－1)等評價指標(biāo)。
　　6.收集患者從手術(shù)之日起至本研究結(jié)束時的預(yù)后資料，計(jì)算患者的5年生存率、中位生存時間。以患者死于結(jié)直腸癌作為終末事件，利用Kapla

9、n-Meier生存曲線、對數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank)及構(gòu)建多因素Cox模型，評價TSP50、p53、CEA及多種臨床病理特征在結(jié)直腸癌中的預(yù)后價值。
　　結(jié)果:
　　1. SW480、SW620、LS174T、HT-29、LoVo、CaCo-2與HCT116等結(jié)直腸癌細(xì)胞株均在mRNA與蛋白質(zhì)兩個水平異常高表達(dá)TSP50.
　　2.8例手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織均異常表達(dá)TSP50，而癌旁組織不表達(dá)或僅有少量表達(dá)。其中7

10、例結(jié)直腸癌組織的TSP50表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的癌旁組織。
　　3.組織芯片的TSP50免疫組織化學(xué)染色結(jié)果為：95例結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)者65例(68.4％)，20例結(jié)直腸腺瘤組織中高表達(dá)者3例(15.0％)，20例結(jié)直腸正常組織中無高表達(dá)者。TSP50在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于結(jié)直腸腺瘤和正常組織(P＜0.0001)。TSP50主要表達(dá)于細(xì)胞漿，但部分結(jié)直腸癌中也能見到細(xì)胞漿與細(xì)胞膜同時表達(dá)。
　　4. TSP50在

11、結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平與p53、CEA及患者性別、年齡，腫瘤的部位、大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、分級等臨床病理特征均無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。直腸癌的p53表達(dá)水平顯著高于結(jié)腸癌(P=0.033)，而高、中分化的結(jié)直腸癌的CEA表達(dá)水平顯著高于低、未分化結(jié)直腸癌(P=0.020)。
　　5. TSP50鑒別診斷結(jié)直腸癌與結(jié)直腸正常組織或腺瘤的敏感性為68.4％、特異性為92.5％、陽性預(yù)測值為95.6％、陰性預(yù)測值為55.

12、2％、約登指數(shù)為60.9％。
　　6. TSP50高表達(dá)患者的5年生存率為42.8％、中位生存時間為48月(95％CI=30.804-65.196)，而低表達(dá)患者的5年生存率為73.3％、中位生存時間為108月(95％CI=96.921-119.079)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TSP50的結(jié)直腸癌患者預(yù)后顯著差于低表達(dá)TSP50的結(jié)直腸癌患者(P=0.010)，這種差異尤其表現(xiàn)在早期(TNM I，II期)結(jié)直腸

13、癌患者中(P=0.004)。進(jìn)一步構(gòu)建多因素Cox模型分析發(fā)現(xiàn)，TSP50在結(jié)直腸癌患者中是一個獨(dú)立的預(yù)后因素(HR=2.205，95％CI=1.214-4.004，P=0.009)。
　　結(jié)論:
　　1. TSP50普遍異常高表達(dá)于結(jié)直腸癌，而在正常結(jié)直腸組織中低表達(dá)或不表達(dá)。結(jié)直腸癌組織的TSP50表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。
　　2. TSP50能夠以較高的特異性與陽性預(yù)測值鑒別診斷結(jié)直腸癌與結(jié)直腸正常組織或腺瘤，