膠原的制備及其對(duì)可植入生物材料表面改性研究.pdf

1、膠原是目前生物材料界研究最多的天然生物材料之一，并且被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。膠原用作為細(xì)胞和基因載體的三維立體凝膠支架，以及在非天然生物材料表面工程中的應(yīng)用是目前研究的熱點(diǎn)。
　　本文從提取膠原入手，以牛腱(T)為原材料，采用酸水解法和酶消化法提取膠原，同時(shí)對(duì)胃蛋白酶(P)和無花果蛋白酶(F)消化提取膠原的工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)表明，P:T＝1:10和F:T＝1:100的消化效果最好；并且從酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的角度給予解釋。通過高速離心、鹽

2、析和透析對(duì)粗膠原提純，選用NaCl進(jìn)行鹽析。通過常規(guī)氨基酸分析、羥脯氨酸含量測(cè)定、紅外(IR)和紫外光譜分析以及等電點(diǎn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)提取物是膠原，同時(shí)從羥脯氨酸含量和SDS-PAGE凝膠電泳分析確定膠原純度較高，分子量大概在300KDa左右；胃蛋白酶提取膠原提取率在75％左右；通過原子力顯微鏡觀察分析酸性提取液中的膠原的聚集態(tài)行為。選用戊二醛(GTA)對(duì)膠原進(jìn)行交聯(lián)，通過扭辮分析、DSC和IR分析確定醛基與膠原的端氨基之間以C=N鍵形式交

3、聯(lián)，交聯(lián)后膠原抗拉強(qiáng)度提高，抗酶降解和生理鹽水降解的能力增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)確定濃度為0.2%(V/V)的GTA對(duì)膠原交聯(lián)60min效果最理想。
　　本文研究了酶消化法提取膠原在凝膠中的自組裝行為，發(fā)現(xiàn)膠原通過磷酸鹽緩沖溶液透析后獲得的凝膠(PBS-凝膠)性能比較優(yōu)越；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PBS-凝膠中的膠原纖維組裝成天然橫紋結(jié)構(gòu)。利用膠原凝膠制備的三維立體支架培養(yǎng)小鼠胚胎內(nèi)皮成纖維細(xì)胞(3T3)，根據(jù)3T3細(xì)胞在不同時(shí)期的生長(zhǎng)狀態(tài)，確定提取的膠原

4、可以用作細(xì)胞的三維立體生長(zhǎng)支架，細(xì)胞在膠原凝膠中生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　由于膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成份，在聚氨酯(PU)和乙丙交酯共聚物(PLGA)表面接枝膠原，可提高其細(xì)胞相容性。本文選擇紫外、臭氧化和等離子體處理三種方式對(duì)材料進(jìn)行活化來接枝膠原。通過人類宮頸癌細(xì)胞(Hela)培養(yǎng)確定合適的處理方法。在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，經(jīng)過紫外和臭氧化處理的材料易降解而使細(xì)胞大量死亡，因此實(shí)驗(yàn)選用等離子體處理進(jìn)行膠原接枝。通過測(cè)定等離子體處理后PU和

5、PLGA材料表面水接觸角確定最佳處理功率為60W，時(shí)間5min。FTIR結(jié)果表明，PU經(jīng)過等離子體處理后，通過羧基和過氧基使膠原成功地接枝到PU表面。XPS分析確定膠原表面的羧基與PLGA表面等離子體激活的羥基發(fā)生了反應(yīng)生成酯基接枝到PLGA表面。選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV)和小鼠胚胎內(nèi)皮成纖維細(xì)胞(3T3)在PU和PLGA材料表面培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)定性觀察確定膠原接枝有利于細(xì)胞的粘附和增殖。采用ImageJ軟件分析田字形九點(diǎn)取相法和四甲基偶

6、氮唑藍(lán)比色法(MTT)對(duì)不同時(shí)期兩種細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，接枝膠原的存在改善細(xì)胞粘附了，加快了細(xì)胞的增殖速度。
　　采用低溫等離子體技術(shù)在PU表面接枝膠原，并制備膠原/聚氨酯(COL/PU)復(fù)合材料，對(duì)PU表面進(jìn)行偽飾。用碘代法檢測(cè)等離子體處理后PU(P-PU)表面活性基團(tuán)濃度。本文選擇兩種方法接枝膠原，直接在P-PU表面接枝膠原稱為一步法，先在P-PU表面接枝中間體再接枝膠原稱為兩步法；通過表面接枝密度的測(cè)定、膠原

7、的粘接強(qiáng)度測(cè)試及XPS分析確定一步法優(yōu)于兩步法。將PU和COL/PU在小鼠皮下埋植，通過定期取材和TEM觀察發(fā)現(xiàn)，COL/PU復(fù)合材料與機(jī)體相容性很好，急性炎癥反應(yīng)在植入后第7天消失，材料被組織包裹形成包囊，而且包囊壁隨時(shí)間逐漸變??；而PU材料在植入1個(gè)月后炎癥反應(yīng)還沒徹底消失，PU與機(jī)體粘附性不好，PU沒有完全被組織包裹形成包囊，易發(fā)生遷移。結(jié)果表明，COL/PU復(fù)合材料具有良好組織相容性及組織引導(dǎo)再生能力，膠原層的存在對(duì)PU的保護(hù)和