偽狂犬病病毒抗原性變異的分子基礎研究.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)可感染不同年齡段的豬，以種豬繁殖障礙、育肥豬生長緩慢、哺乳仔豬高死亡率為特征。過去30年來，以Bartha-K61為代表的基因缺失疫苗株在我國廣泛使用，偽狂犬病已得到有效控制。然而自2011年以來，Barha-K61疫苗免疫豬群頻繁暴發(fā)偽狂犬病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。研究證明導致免疫豬群發(fā)病的是一種變異的PRV，此病毒的致病力比經(jīng)典的PRV更強，以Bartha-K61為代表的

2、經(jīng)典偽狂犬病毒基因缺失疫苗不能針對變異的PRV為豬群提供完全免疫保護。全病毒基因組比較分析發(fā)現(xiàn)變異的PRV與經(jīng)典的PRV相比已形成一個獨立的遺傳進化分支，糖蛋白B(GlycoproteinB，gB)是PRV最主要的保護性抗原，因此推測gB基因的變異可能是導致經(jīng)典的偽狂犬病疫苗不能完全保護變異PRV的主要原因。為此，本實驗將變異PRV的gB基因和Bartha-K61的gB基因互換以探討gB基因在變異PRV免疫保護中的作用，為進一步開發(fā)針對

3、變異PRV的新型疫苗奠定基礎。
　　變異PRV流行毒株與疫苗毒株Bartha-K61的主要保護性抗原蛋白進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，PRV變異株的主要保護性抗原存在不同程度的變異。其中，gB基因進化樹里PRV變異毒株聚集在一起形成獨立分支，與國外經(jīng)典毒株以及國內早期流行毒株均相距較遠，并且在gB抗原表位區(qū)域PRV變異株JS-2012與Bartha-K61存在多處氨基酸缺失和替換。這表明PRV變異毒株的gB蛋白極有可能發(fā)生了抗原變異。<

4、br>　　gB基因互換重組PRV的構建。以經(jīng)典偽狂犬病疫苗Bartha-K61和本實驗室構建的變異PRV基因缺失病毒JS-2012-ΔgE/gI為基礎，使用CRISPR/Cas9基因編輯技術結合同源重組互換兩者的gB基因，不經(jīng)過標記基因的插入刪除，成功拯救并篩選到重組病毒BJB(Bartha-K61-JS-2012gB)和JBJ(JS-2012-ΔgE/gI-Bartha-K6 lgB)。重組病毒與親本毒在體外生物學分析中具有相似的生長

5、特性，且小鼠致病性沒有顯著差異。這表明成功獲得gB替換的重組病毒，為PRV變異毒株gB抗原變異評價分析提供了平臺。
　　gB基因互換的重組PRV能夠顯著改變彼此的免疫原性。將構建的gB互換的重組毒株以及親本毒株分別制備滅活病毒，免疫小鼠后用變異的PRV JS-2012株進行攻毒試驗。結果發(fā)現(xiàn)與其親本毒株Bartha-K61比較，更換了gB基因的重組Bartha-K61(BJB)的免疫保護效率顯著提高;相反，與親本毒株JS-2012

6、-ΔgE/gI比較，更換gB基因的重組JS-2012-ΔgE/gI(JBJ)的免疫保護效率顯著下降。這表明gB蛋白是PRV主要保護性抗原，gB基因變異能夠顯著影響PRV的免疫原性，進一步說明gB基因變異是現(xiàn)有疫苗Bartha-K61不能完全保護豬免于變異PRV攻擊的主要原因。
　　糖蛋白C(Glycoprotein C，gC)基因互換重組PRV的構建。生物信息學分析結果顯示PRV變異株的保護性抗原gC也與經(jīng)典PRV差異較大，為探究

7、其抗原變異對PRV交叉免疫保護的影響，在gB互換的基礎上，使用CRISPR/Cas9基因編輯技術結合同源重組對gC基因進一步替換，成功構建并篩選到gC和gB雙互換的重組病毒BJbcB(含JS-2012 gB和gC基因的重組Bartha-K61)和gC基因互換的重組病毒JBcJ（含Bartha-K61 gC基因的重組JS-2012-ΔgE/gI），為下一步研究gC蛋白在保護性免疫中的作用奠定了基礎。
　　綜上所述，本研究為PRV變異