熱休克蛋白70在紫外線致DNA損傷修復中的作用.pdf

1、真核生物和原核生物在高溫、接觸毒物和其它各種應激因素(如煙堿、一氧化碳、重金屬、電離輻射、缺血缺氧等)等有害因素作用時，生物體會迅速啟動高度程序化的熱休克反應(heatshockresponse，HSR)，誘導合成一組高度保守的熱休克蛋白質(heatshockproteins，Hsps)。Hsps是生物界(包括從細菌到人的生物)經(jīng)過長期進化仍舊保留下來的、對體內外不良因素起保護作用的一類蛋白質。根據(jù)Hsps在SDS-PAGE上的結果，按

2、其分子量大小將Hsps分為如下幾個家族：大分子HSPs(≥100kD)，HSP90(81-99kD)，HSP70(65-80kD)，HSP60(55-64kD)，HSP40(35-54kD)，小分子HSPs(≤34kD)，其中最為主要和重要的是HSP70家族的Hsp70。 Hsp70正常時分布在細胞漿，而有害因素應激時則分布在細胞核，且分布于染色體周圍，這個重要現(xiàn)象提示了Hsp70在DNA保護中的可能作用與意義。DNA修復是一個

3、重要的研究方向，而大多數(shù)研究均只從不同的DNA修復來研究它們的重要作用與機制，但很少同時考慮到DNA損傷，更少考慮到重要蛋白質在DNA損傷與修復平衡中的作用。Hsp70是重要的分子伴侶，參與蛋白質的合成、折疊、裝配和運輸以及變性蛋白質的清除等，無疑它也可能與DNA損傷和修復相關酶的合成和功能有關。 本研究通過構建Hsp70表達升高和降低兩種細胞模型，用紫外線C作為DNA損傷劑，利用彗星實驗、Western-blot技術、實時定量

4、RT-PCR等方法來觀察Hsp70表達不同水平細胞中的DNA損傷和修復情況，來探討Hsp70在DNA損傷和修復過程的可能作用。本研究共分三部分。 第一部分Hsp70過表達及Hsp70表達抑制細胞模型的建立 對于Hsp70過表達細胞模型的建立，我們采用pcDNA3.0/hsp70重組質粒進行細胞轉染并用G418篩選穩(wěn)定的Hsp70高表達細胞株(A549/hsp70)?？蛰d體質粒pcDNA3.0轉染細胞作為平行轉染對照(A5

5、49/pcDNA)。 對于Hsp70表達抑制細胞模型的建立我們用了槲皮素抑制Hsp70表達和RNA干擾技術兩種方法并進行了比較。 第二部分Hsp70在紫外線致DNA損傷中的作用 為闡明紫外線照射不同Hsp70表達后A549細胞DNA損傷的情況，本研究應用MTT試驗、彗星試驗(單細胞瓊脂糖凝膠電泳)，檢測了紫外線C(UVC)照射不同劑量(10、20、40和80J/m2)對A549、A549/quercetin和A5

6、49/hsp70細胞DNA損傷的Olive尾矩。 第三部分Hsp70在紫外線致主要核苷酸切除修復酶mRNA變化中的作用 為了進一步探討Hsp70在DNA修復過程中的作用，利用實時定量RT-PCR技術檢測了UVC照射不同劑量(10、20、40和80J/m2)對A549、A549/quercetin和A549/hsp70細胞中核苷酸切除修復途徑上DNA修復酶XPA、XPC、XPB、XPF、XPG和ERCC1基因mRNA的表達

7、，同時觀察了Hsp70蛋白水平和DNA核苷酸切除修復酶mRNA表達的相關關系。 綜上所述，本研究結果表明： (1)確定了槲皮素抑制A549細胞Hsp70表達的最佳劑量，150μmol/L的槲皮素可以有效抑制A549細胞Hsp70表達；采用含hsp70基因cDNA重組質粒進行細胞轉染并經(jīng)篩選建立了穩(wěn)定的Hsp70過表達細胞株。 (2)初步篩選了RNAi抑制Hsp70的有效序列(5'-CTTATGAACCACTTTG

8、ATTTGC-3')。 (3)Hsp70可以減輕紫外線C中低劑量(≤40J/m2)引起的A549細胞DNA損傷。 (4)紫外線C照射Hsp70表達抑制和Hsp70過表達細胞后的核苷酸切除修復過程中的DNA修復基因mRNA表達變化為：XPA表達在紫外線照射40J/m2時，A549/hsp70組表達明顯降低而A549/quercetin組未見明顯降低；XPC表達在20J/m2和40J/m2時紫外線照射時，A549/hsp70

9、組明顯升高，而A549/quercetin組未見變化；XPB表達在紫外線照射的各劑量組，A549/quercetin組明顯升高，A549/hsp70組與A549組相比未見顯著性差異；XPF在紫外線照射的高劑量時，A549/hsp70組表達明顯升高；XPG在紫外線照射的高劑量時，A549/hsp70組表達明顯升高；ERCC1在紫外線照射低劑量時，A549/hsp70組表達明顯升高。 (5)UVC照射下，Hsp70蛋白與DNA核苷酸

10、切除修復酶基因XPA、XPB、XPF、XPG、ERCC1mRNA表達之間存在相關關系，而Hsp70蛋白與XPCmRNA表達之間未發(fā)現(xiàn)相關關系。 本研究的創(chuàng)新之處在于：(1)同時使用了Hsp70升高和降低的細胞模型，為探討Hsp70的功能提供有力的依據(jù)，可以從正反兩個方面同時驗證Hsp70的功能和作用；(2)同時考慮到了Hsp70在DNA的損傷和修復過程中的作用，而不是單純的損傷或修復。 本課題有待深入研究的方面有：(1)

11、關于Hsp70表達抑制的模型，應該進一步用特異性的手段。針對RNAi技術存在的一些問題加以改進，比如繼續(xù)篩選更加有效的siRNA序列、通過穩(wěn)定轉染篩選低Hsp70表達穩(wěn)定的細胞株來進行實驗；(2)Hsp70與DNA修復的關系還有待于進一步的研究和探索，尤其是Hsp70參與DNA修復的具體機制還有待于證實；(3)可以通過激光共聚焦、染色質免疫沉淀等方法來檢測Hsp70蛋白與DNA修復酶之間的交互作用；(4)DNA整體修復能力的測定如何應用