禽致病性大腸桿菌亞單位疫苗候選抗原的免疫原性研究.pdf

1、由禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenicEscherichia coli,APEC）所引起的局部或全身性感染的疾病統(tǒng)稱為大腸桿菌病，其主要引起大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌性肉芽腫、氣囊病、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、卵黃囊感染、輸卵管炎、滑膜炎等。目前，由于抗生素的大量不合理使用，禽致病性大腸桿菌的耐藥菌株越來越多，使得藥物治療面臨極大的困難。因此，研制出一種具有交叉保護(hù)力的疫苗十分重要。IutA蛋白、IroN蛋白和Gro

2、EL蛋白廣泛存在于禽致病性大腸桿菌菌株中，尤其是強(qiáng)毒菌株。本研究以禽致病性大腸桿菌為研究對象，將IutA蛋白、IroN蛋白和GroEL蛋白作為亞單位疫苗的一種候選抗原，開發(fā)一種具有廣泛保護(hù)性的疫苗。
　　巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是基因工程研究中廣泛使用的真核表達(dá)系統(tǒng)。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，具有易于培養(yǎng)，繁殖快，適合高密度發(fā)酵及不產(chǎn)生有毒物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)IutA蛋白、Iro

3、N蛋白和GroEL蛋白，其主要工作如下：
　　1.重組巴斯德畢赤酵母（Pichia.pastoris）工程菌株的構(gòu)建及表達(dá)
　　以ACN001菌株基因組為模板將iutA基因、iroN基因、groEL基因克隆入pPICZαA表達(dá)質(zhì)粒，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-iutA、pPICZαA-iroN和pPICZαA-groEL，將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)GS115細(xì)胞中。通過博來霉素篩選高表達(dá)的pPICZαA-

4、iutA/GS115、pPICZαA-iroN/GS115和pPICZαA-groEL/GS115的工程菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
　　2.三組分重組亞單位疫苗的制備
　　使用BCA試劑盒測定鎳柱純化后的重組蛋白的濃度，將三種蛋白以一定的比例混合（疫苗中的每種重組蛋白按劑量以50μg混勻），用佐劑進(jìn)行乳化蛋白，配制成禽致病性大腸桿菌三組分亞單位疫苗。
　　3.交叉免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)
　　小鼠免疫實(shí)驗(yàn)表明，以 ACN001（O