糖尿病自主神經(jīng)病變對(duì)心臟電生理的影響及其干預(yù)研究.pdf

1、研究背景:糖尿病是當(dāng)今對(duì)人類健康最具威脅性的疾病之一，隨其發(fā)病率的逐年增加，其危害性也越來越顯著，給患者及社會(huì)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病存在多種并發(fā)癥，對(duì)機(jī)體的重要臟器和組織都造成嚴(yán)重?fù)p害。其中糖尿病心臟自主神經(jīng)病變(diabetic cardiac autonomic neuropathy，DCAN)是最嚴(yán)重但卻最容易被忽視的并發(fā)癥之一。流行病學(xué)研究資料顯示約有35％-65％左右的糖尿病患者會(huì)并發(fā)心臟自主神經(jīng)病變，且隨糖尿病病程延長發(fā)

2、病率呈增長趨勢(shì)，最終導(dǎo)致惡性心律失常、心力衰竭、心肌梗死以及心源性猝死的發(fā)生率顯著增加，嚴(yán)重威脅糖尿病患者的健康。近期多項(xiàng)研究表明合并DCAN的患者其室性心律失常發(fā)生率較單純糖尿病患者顯著增加，且多伴有明顯的QT間期延長，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致猝死發(fā)生率增加，但關(guān)于其導(dǎo)致室性心律失常的機(jī)制和有效干預(yù)治療方面的研究甚少。
　　心臟自主神經(jīng)包含交感神經(jīng)及迷走神經(jīng)，二者互為補(bǔ)充也互相拮抗，共同精細(xì)地調(diào)節(jié)著心臟的生理功能。長期高血糖狀態(tài)可引起缺血

3、缺氧、氧化應(yīng)激、多元醇通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物以及神經(jīng)生長營養(yǎng)因子的缺乏等多因素的激活，這些綜合因素協(xié)同作用造成心臟自主神經(jīng)的損傷。由于迷走神經(jīng)節(jié)前纖維較長，對(duì)缺氧耐受性差，故在糖尿病自主神經(jīng)病變中，迷走神經(jīng)損傷較早且較重，后期迷走、交感神經(jīng)均受累，但在不同部位受累程度存在差異，形成類似去神經(jīng)支配的心臟。任何心臟自主神經(jīng)的去神經(jīng)化不均衡，其中包含區(qū)域性交感神經(jīng)間的分布不均勻、交感與迷走神經(jīng)間的失衡等，均會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)部位電生理的異質(zhì)性增加，

4、使室性心律失常發(fā)生率明顯增加。
　　既往研究證實(shí)在糖尿病神經(jīng)病變大鼠心臟中存在交感神經(jīng)分布的不均衡性，這種失衡尤其在左室近、遠(yuǎn)端表現(xiàn)更為突出。隨糖尿病病程延長，左室遠(yuǎn)端交感神經(jīng)去神經(jīng)化的程度明顯重于近端，形成由近及遠(yuǎn)的交感神經(jīng)損傷梯度改變。而這種交感神經(jīng)的去神經(jīng)化趨勢(shì)和該部位神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）的下調(diào)程度相互吻合。提示NGF的下調(diào)可能是參與DCAN的機(jī)制之一。本研究第一部分進(jìn)一步探討糖尿病

5、大鼠在合并心臟自主神經(jīng)損害時(shí)心臟左室近、遠(yuǎn)端NGF下調(diào)與交感神經(jīng)去神經(jīng)化程度的相關(guān)性，探索糖尿病中失衡的心臟交感神經(jīng)分布與室性心律失常之間的關(guān)系，并在大鼠左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)局部注射外源性NGF，觀察其能否改善DCAN所導(dǎo)致的左室近、遠(yuǎn)端交感神經(jīng)分布不均衡，從而減少室性心律失常的發(fā)生，以期為DCAN與其繼發(fā)的室性心律失常的治療提供新的思路。
　　除心臟交感神經(jīng)失衡引起室性心律失常發(fā)生率增加外，因交感和迷走神經(jīng)對(duì)損傷的敏感程度不同，DCA

6、N還會(huì)引起交感和迷走神經(jīng)的失衡，這同樣會(huì)造成心臟電生理的不穩(wěn)定性增加，室性心律失常發(fā)生率隨之增加。我們的思路是通過干預(yù)性治療，改善糖尿病造成的心臟交感和迷走神經(jīng)之間的失衡問題，增加電生理的穩(wěn)定性，從而減少室性心律失常發(fā)生。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為一種自體干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新及增殖能力，并具有多向分化的潛能。MSCs在體內(nèi)、體外特定誘導(dǎo)條件下可分化為神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，并可通

7、過旁分泌機(jī)制分泌多種神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子，因此可作為理想的種子細(xì)胞用于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療。鑒于MSCs的生物學(xué)特性，我們推斷MSCs移植治療可能會(huì)對(duì)DCAN產(chǎn)生積極有效作用。本研究第二部分中，我們?cè)谔悄虿〈笫竽Ｐ突A(chǔ)上行心肌內(nèi)MSCs移植，觀察MSCs移植對(duì)DCAN的修復(fù)作用以及對(duì)心臟電生理穩(wěn)定性的影響，探討其修復(fù)甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病導(dǎo)致的心臟自主神經(jīng)損害的機(jī)制，以期為DCAN提供新的治療手段及理論依據(jù)。
　　如上所述，本研究在既往研究基礎(chǔ)

8、上，進(jìn)一步深入闡明NGF表達(dá)下調(diào)與糖尿病心臟交感神經(jīng)去神經(jīng)化的相關(guān)性，探討DCAN與室性心律失常的關(guān)系，通過不同方法對(duì)DCAN進(jìn)行干預(yù)性治療，以期為糖尿病心臟自主神經(jīng)病變及其繼發(fā)的室性心律失常的防治提供新的治療思路。為了詳細(xì)闡明上述問題，本課題通過以下兩部分研究進(jìn)行探討:
　　第一部分、神經(jīng)生長因子干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠心臟交感神經(jīng)分布及室性心律失常的影響
　　目的:
　　明確糖尿病心臟左室交感神經(jīng)病變特點(diǎn)，探討NGF下調(diào)與

9、左室交感神經(jīng)去神經(jīng)化的相關(guān)性，通過在糖尿病大鼠左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)注入外源性NGF，以期為DCAN及其繼發(fā)的室性心律失常的防治提供治療思路。
　　材料與方法:
　　雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組（control組，n=12）;糖尿病組(DM組，n=16);糖尿病+NGF干預(yù)組（DN組，n=16）。通過腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(50mg/kg)制備糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠成模后繼續(xù)喂養(yǎng)24周，DN組在左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射NG

10、F（總量20μg/kg，分成4次注射完成，每隔3天注射一次），DM組在左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)注入同等體積的生理鹽水。繼續(xù)喂養(yǎng)至28周，所有存活大鼠測(cè)定空腹血糖及糖化血紅蛋白，隨后行程序性電刺激誘發(fā)室性心律失常，電生理試驗(yàn)結(jié)束后處死所有大鼠，立即取心臟左室近、遠(yuǎn)端心肌組織，采用免疫組織化學(xué)方法觀察酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性神經(jīng)纖維分布及密度;實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)心肌中TH mRNA、NGF mRNA表達(dá)

11、;Western blot檢測(cè)心肌組織中NGF蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　DM組大鼠QTc和QTcd均比對(duì)照組大鼠顯著延長(P＜0.01)，且室性心律失常誘發(fā)率顯著增加(46.5％ vs.7.14％，P＜0.01)。同時(shí)在DM組大鼠心臟左室的近、遠(yuǎn)端TH陽性神經(jīng)纖維的密度和相應(yīng)的TH mRNA以及NGF蛋白水平均分別比對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)。且在DM組大鼠心臟左室近、遠(yuǎn)端TH陽性神經(jīng)纖維的密度、相應(yīng)的TH mRNA和

12、NGF之間均存在顯著差異性(P＜0.01)。在DN組NGF注入糖尿病大鼠左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)后，左室近、遠(yuǎn)端TH陽性神經(jīng)纖維密度和相應(yīng)的TH mRNA以及NGF蛋白水平均較DM組顯著升高(P＜0.01)，且近、遠(yuǎn)端之間比較差異均無顯著性(P＞0.05)。同時(shí)NGF干預(yù)后DN組大鼠QTc和QTcd均比DM組顯著縮短(P＜0.01)，程序電刺激實(shí)驗(yàn)中室性心律失常的誘發(fā)率較DM組顯著減少(15.38％ vs.46.15％，P＜0.01)，與正常對(duì)

13、照組比較差異無顯著性（15.38％ vs.7.14％，P＞0.05）。
　　結(jié)論:DCAN可引起心臟左室近、遠(yuǎn)端NGF水平的不均勻下調(diào)，與相應(yīng)部位交感神經(jīng)去神經(jīng)化的不均衡程度相吻合。心臟交感神經(jīng)的不均衡支配可增加心臟電生理異質(zhì)性，并導(dǎo)致心律失常易感性的增加。NGF干預(yù)可促進(jìn)糖尿病大鼠心臟交感神經(jīng)再生，糾正DCAN導(dǎo)致的交感神經(jīng)支配失衡，降低心臟電生理異質(zhì)性及室性心律失常的易感性。
　　第二部分、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)糖尿病心

14、臟自主神經(jīng)病變及電生理的影響及其機(jī)制
　　目的:
　　探討MSCs移植對(duì)糖尿病心臟自主神經(jīng)病變的修復(fù)作用及其可能機(jī)制，為糖尿病心臟自主神經(jīng)病變提供新的治療手段及理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　選取4周左右Wistar大鼠股骨及脛骨分離MSCs，傳代后凍存?zhèn)溆谩?0只糖尿病成模大鼠被隨機(jī)分成為3組（每組10只）:DM組;DM+MSC治療組;DM+MSC條件培養(yǎng)基組。另外10只非糖尿病大鼠被作為空白對(duì)照組。糖尿病成

15、模16周后開胸行MSCs心肌內(nèi)移植。MSCs移植2周后利用小動(dòng)物無線遙測(cè)系統(tǒng)分析心率變異性，隨后所有大鼠行程序電刺激誘發(fā)室性心律失常。電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，立即取左室心肌組織。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)生長相關(guān)蛋白43(growthassociated protein43，GAP43)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(holine acetyltransferase，ChAT)和酪氨酸羥化酶化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性神經(jīng)

16、纖維在心肌的表達(dá)及分布情況。為明確旁分泌作用部分介導(dǎo)了MSCs促進(jìn)心臟自主神經(jīng)再生作用，在本實(shí)驗(yàn)中，我們提取MSCs培養(yǎng)的上清并注射入心肌，利用ELISA試劑盒檢測(cè)MSCs培養(yǎng)上清中NT-3和NGF的含量，并與單純細(xì)胞培養(yǎng)基組進(jìn)行對(duì)比分析。
　　結(jié)果:
　　與單純DM組相比，MSCs移植組大鼠心臟左室GAP43、TH、ChAT陽性神經(jīng)纖維密度均顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，且ChAT/TH陽性纖維比例提高（0.37

17、±0.014vs0.27±0.020，P＜0.01），提示MSCs移植后可促進(jìn)心臟自主神經(jīng)再生，且可增加迷走神經(jīng)支配比例，恢復(fù)心臟迷走與交感神經(jīng)支配的平衡;MSCs移植2周后，利用小動(dòng)物無線遙測(cè)系統(tǒng)行心率變異性分析，與單純DM組相比，MSCs移植組SDNN、LF、HF等指標(biāo)均顯著增加(P＜0.01)，且LF/HF比例顯著降低(P＜0.01);電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs移植組室性心律失常易感性較DM組顯著降低(P＜0.01)。ELISA試

18、劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MSCs培養(yǎng)上清中NT-3和NGF含量均較單純細(xì)胞培養(yǎng)基組顯著增加(P＜0.01)，提示MSCs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子是促進(jìn)心臟自主神經(jīng)再生的重要因素。在實(shí)驗(yàn)過程中，MSCs心肌移植后未發(fā)現(xiàn)致瘤現(xiàn)象，初步證實(shí)了MSCs移植治療糖尿病心臟自主神經(jīng)病變的安全性。
　　結(jié)論:
　　MSCs心肌內(nèi)移植后，除了促進(jìn)糖尿病心臟自主神經(jīng)再生外，還可增加迷走神經(jīng)比例，改善糖尿病造成的迷走神經(jīng)與交感神經(jīng)的失衡狀態(tài)，降低室性心律失常易感