抗豬偽狂犬病病毒糖蛋白gE和雞IFIT5單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、豬偽狂犬病病毒(PRV)是引起豬偽狂犬病(PR)的病原體，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PR的防治主要依靠疫苗免疫，弱毒疫苗Batha K-61在中國(guó)廣泛應(yīng)用，并在上世紀(jì)90年代對(duì)PR疫情控制起到良好作用，但是2011年以來(lái)不同疫苗免疫的豬場(chǎng)均出現(xiàn)轉(zhuǎn)陽(yáng)情況，PR再次流行。Batha K-61疫苗株缺失了整個(gè)gE基因，因此gE蛋白是鑒別野毒和疫苗毒感染的標(biāo)志蛋白。
　　為區(qū)分Batha K-61疫苗株與野毒株，本研究制備針對(duì)

2、gE蛋白的單克隆抗體。利用原核表達(dá)系統(tǒng)，體外表達(dá)了PRV-DX毒株糖蛋白gE的主要抗原表位區(qū)域蛋白，以純化的重組His-gE蛋白為免疫原免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，結(jié)合ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）、IFA（間接免疫熒光試驗(yàn)），應(yīng)用有限稀釋克隆法篩選，獲得了三株針對(duì)PRV糖蛋白gE(1H12，2E7，2E9)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。Western blot與IFA檢測(cè)顯示，獲得的三株單抗與重組蛋白His-gE、

3、PRV感染細(xì)胞病毒蛋白gE以及轉(zhuǎn)染的gE蛋白均有良好反應(yīng)。
　　應(yīng)用所制備的單克隆抗體，能夠正確區(qū)分Batha K-61疫苗株與PRV-DX野毒株;以PRV-DX株分別感染不同細(xì)胞，連續(xù)傳代6代，并以gE單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示除Veto細(xì)胞、PK-15細(xì)胞外，PRV-DX株還可以穩(wěn)定感染MDCK細(xì)胞、Marc145細(xì)胞、CEF細(xì)胞，卻不能穩(wěn)定感染DF-1細(xì)胞。
　　IFIT家族蛋白屬于ISGs，病毒、細(xì)菌以及干擾素刺激

4、時(shí)該家族蛋白大量表達(dá)，在宿主抗病毒以及先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，禽類只有IFIT5蛋白。在禽傳染性法氏囊病毒(IBDV)感染DF-1細(xì)胞的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)，雞源IFIT5(chIFIT5)蛋白在胞漿內(nèi)上調(diào)表達(dá)，但作用機(jī)制尚不清楚，目前缺乏IFIT5蛋白檢測(cè)的特異性抗體。本研究體外克隆了chIFIT5基因，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出His-IFIT5重組蛋白。以純化的His-IFIT5蛋白為免疫原免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠的

5、脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，結(jié)合ELISA和Western blot技術(shù)，應(yīng)用有限稀釋克隆法篩選，結(jié)果獲得了四株針對(duì)chIFIT5蛋白(1A10、1A11、2A3和2H8)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。Western blot分析顯示，四株單抗與重組蛋白His-IFIT5、IBDV感染的DF-1細(xì)胞內(nèi)IFIT5蛋白以及真核轉(zhuǎn)染Myc-IFIT5蛋白均有良好的反應(yīng)，IFA檢測(cè)則不反應(yīng)。chIFIT5蛋白的特異性單克隆抗體的獲得為進(jìn)一步開(kāi)展禽類IFIT