has-microRNA-212調(diào)控組蛋白去甲基化酶RBP2抑制胃癌細(xì)胞增殖的初步研究.pdf

1、目的:
　　 研究胃癌中可調(diào)節(jié)組蛋白去甲基化酶RBP2表達(dá)的特定MicroRNA,進(jìn)而研究其對(duì)RBP2表達(dá)以及胃癌細(xì)胞增殖的影響和作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 利用生物信息學(xué)方法,在TargetScan,miRanda和miRBase等miRNA數(shù)據(jù)庫中分別預(yù)測(cè)能夠靶向調(diào)節(jié)RBP2的miRNA:將各數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析,尋找在各個(gè)數(shù)據(jù)庫中均存在的特定miRNA作為研究對(duì)象。
　　 在19對(duì)中國人胃

2、原位癌及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中分別利用QRT-PCR和免疫組化法檢測(cè)miR-212和RBP2的表達(dá)情況。
　　 利用分子克隆的方法分別構(gòu)建miR-212高表達(dá)質(zhì)粒pS-miR-212、抑制miR-212表達(dá)質(zhì)粒anti-miR-212、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pMIR-REPORT/RBP2/3'UTR以及三種突變熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pMIR-REPORT/RBP2/3'UTR mutant1(結(jié)合區(qū)1突變),2(結(jié)合區(qū)2突變),3(結(jié)合區(qū)1

3、,2均突變)。
　　 利用脂質(zhì)體將pS-miR-212、anti-miR-212以及兩者的對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到AGS,BGC-823和GES-1細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后利用Trizol提取其總RNA。利用miR-212特異RT及PCR引物分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR來檢測(cè)各質(zhì)粒對(duì)胃癌細(xì)胞miR-212表達(dá)的調(diào)控作用。為了確定miR-212是否靶向調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中RBP2表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄后,利用熒光定量PCR和Western blotti

4、ng檢測(cè)各組中RBP2的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　 為了確定預(yù)測(cè)獲得的RBP23'UTR上的miR-212結(jié)合位點(diǎn)是否參與調(diào)節(jié)RBP2的表達(dá),我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因分析。將pMIR-REPORT/RBP2/3'UTR,3種突變熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及pMIR-REPORTβ-gal對(duì)照質(zhì)粒分別和pS-miR-212或其對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入GES細(xì)胞中。分別測(cè)定其熒光素酶活性。為了確定miR-212對(duì)p21CIP1和p27kip1表

5、達(dá)的影響,將pS-miR-212、anti-miR-212以及兩者的對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染AGS、BGC-823和GES-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后利用熒光定量PCR檢測(cè)p21CIP1和p27kip1 mRNA表達(dá)情況。為了研究miR-212靶向調(diào)控RBP2的生物學(xué)效應(yīng),我們使用AGS和GES-1細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。將pS-miR-212、anti-miR-212以及兩者的對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染AGS和GES-1細(xì)胞,在孵箱中培養(yǎng)7～10天。經(jīng)固定,

6、染色后計(jì)數(shù)克隆數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)過對(duì)在不同數(shù)據(jù)庫中搜索得到的結(jié)果進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)miR-212最有可能結(jié)合到RBP2的3'UTR區(qū)域。RBP2的3]UTR區(qū)域含有兩個(gè)miR-212的潛在結(jié)合位點(diǎn)。
　　 與相應(yīng)的癌旁正常組織相比,在胃癌組織中,miR-212表達(dá)下降,RBP2異常高表達(dá)。
　　 各種質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,插入序列正確,質(zhì)粒構(gòu)建成功。細(xì)胞轉(zhuǎn)染pS-miR-212質(zhì)粒后,miR-212表達(dá)量

7、與對(duì)照細(xì)胞相比明顯上升。細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-212質(zhì)粒后,miR-212表達(dá)量與對(duì)照細(xì)胞相比明顯下降。在轉(zhuǎn)染pS-miR-212質(zhì)粒的細(xì)胞中,RBP2的mRNA和蛋白水平明顯下降。在轉(zhuǎn)染anti-miR-212質(zhì)粒的細(xì)胞中,RBP2的mRNA和蛋白水平明顯上升。以上結(jié)果表明,在胃癌細(xì)胞中miR-212通過影響RBP2 mRNA的穩(wěn)定性來抑制RBP2表達(dá)。
　　 轉(zhuǎn)染了pS-miR-212的細(xì)胞中的熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染空對(duì)照的

8、細(xì)胞相比明顯下降,表明miR-212通過直接結(jié)合到RBP2的3'UTR區(qū)域來調(diào)節(jié)RBP2表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-212結(jié)合位點(diǎn)單突變熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒會(huì)減弱miR-212介導(dǎo)的熒光素酶活性降低,而轉(zhuǎn)染miR-212結(jié)合位點(diǎn)雙突變熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒會(huì)完全消除miR-212介導(dǎo)的熒光素酶活性降低,表明miR-212能夠直接結(jié)合到RBP2的3'UTR區(qū)域的兩個(gè)miR-212潛在結(jié)合位點(diǎn),從而調(diào)節(jié)RBP2的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染pS-miR-212的細(xì)胞中,p21

9、CIP1和p27kip1的mRNA水平上升。而在轉(zhuǎn)染anti-miR-212的細(xì)胞中,p21CIP1和p27kip1的mRNA水平下降。miR-212能夠影響胃癌細(xì)胞的克隆形成能力。與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)染pS-miR-212的細(xì)胞克隆數(shù)量減少而轉(zhuǎn)染anti-miR-212的細(xì)胞克隆數(shù)量上升。結(jié)果表明,在體外,miR-212抑制人胃癌細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)論:
　　 在本研究中,miR-212被確定為能夠調(diào)節(jié)RBP2表達(dá)的特異Mi