肝癌5-FU緩釋微粒間質(zhì)化療的實驗及臨床研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(primay hepatic carlcer,PHC)是全世界最常見的惡性實體腫瘤之一,也是第三大癌癥相關(guān)性死亡因素,每年至少有50萬新發(fā)病例。包括中國東南,臺灣,香港,韓國,泰國,新加坡,馬來西亞的東南亞地區(qū)和熱帶非洲國家是全球發(fā)病率最高的地區(qū),年發(fā)病率10-20/10萬,且發(fā)病率呈上升趨勢。大多數(shù)肝癌合并有肝硬化,主要的致病因素有病毒性肝炎,酗酒及黃曲霉素的攝入。肝癌患者預(yù)后較差,未經(jīng)治療的肝癌患者的自然生存時間僅為8.

2、4個月。肝切除術(shù)是治療肝癌的有效方法,然而只有10-20％的肝癌在診斷時具有可切除性。化療是肝癌治療重要的輔助手段。但傳統(tǒng)的靜脈化療雖然有一定的效果,但全身副作用較大,患者往往難以耐受。因此改變給藥途徑,即通過局部或區(qū)域性給藥,能大大提高腫瘤區(qū)域內(nèi)化療藥物的濃度,增加化療藥物對腫瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性作用,并有效地降低了全身副作用。隨著抗腫瘤藥物緩釋劑型的技術(shù)改進(jìn)和對給藥途徑的觀念更新,區(qū)域性化療：即腹腔內(nèi)化療、肝動脈灌注化療、門靜脈灌注

3、化療、間質(zhì)化療等方法,日益成為治療肝癌的有效方法及手段。而間質(zhì)化療是當(dāng)前研究的熱點。所謂間質(zhì)化療(interstitial chemotherapy,IC),即將抗癌藥制備成具有緩釋作用的給藥系統(tǒng),經(jīng)不同方式植入(注入)腫瘤組織、瘤周組織的間質(zhì)中或腫瘤切除后的瘤床,從而達(dá)到局部組織的持續(xù)、高效的藥物濃度,同時降低全身的不良反應(yīng)。 有鑒于此,從上個世紀(jì)90年代開始,國外部分學(xué)者和吳院士開始進(jìn)行肝癌間質(zhì)化療的研究。在成功進(jìn)行了肝癌腹

4、腔內(nèi)化療、肝動脈灌注化療、門靜脈灌注化療等方法的基礎(chǔ)上,開始間質(zhì)化療的實驗研究,并且從2003年開始嘗試將緩釋化療藥物植入肝癌組織、癌周組織中或肝癌切除后的瘤床。 目的：本課題擬通過細(xì)胞實驗來證實植入用緩釋5-FU能持續(xù)抑制肝癌細(xì)胞的生長,導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡,并且5-FU是以時間依賴性方式抑制肝癌,所以進(jìn)一步充實植入用緩釋5-FU應(yīng)用于臨床的理論依據(jù)。并且通過300例肝癌患者,按隨機數(shù)字表分為5-FU緩釋微粒植入組和對照組。植入

5、組150例在肝癌切除術(shù)中同時植入緩釋5-Fu微粒600mg,隨訪其術(shù)后的復(fù)發(fā)率以及生存率來具體評估肝癌間質(zhì)化療的療效,以期得到指導(dǎo)肝癌間質(zhì)化療的證據(jù)。 方法： (一)MTT(噻唑藍(lán))法檢測植入用緩釋5-FU抑制人肝癌細(xì)胞生長的實驗 1.HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)。 用植入用緩釋5-FU100mg放入2ml dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)液中,分別取植入用緩

6、釋5-FU釋放后第0d,第1d,第7d,第14d,第21d和第28d的培養(yǎng)液來培養(yǎng)HepG2肝癌細(xì)胞。 2.觀察HepG2細(xì)胞增殖形態(tài)培養(yǎng)72h后于倒置相差顯微鏡下拍攝細(xì)胞狀態(tài)。 3.MTT法檢測HepG2細(xì)胞增殖培養(yǎng)72h后加入MTT繼續(xù)孵育,4 h后終止培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀在560 nm波長下測定吸光度A,細(xì)胞存活率(％)=(試驗孔A值/對照孔A值)×100％。 (二)植入用緩釋5-FU誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實驗研究

7、 1.取植入用緩釋5-FU釋放后第0d,第1d,第7d,第14d,第21d和第28d的培養(yǎng)液來培養(yǎng)HepG2肝癌細(xì)胞72h。采用Hochest染色試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。 2.用緩釋5-FU浸泡第0d,第1d,第7d,第14d,第21d和第28d的培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞72h后,用Annexin-V-FITC和PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。 (三)肝癌行肝臟切除術(shù)中植入緩釋5-FU的臨床試驗 300例肝

8、癌患者,按隨機數(shù)字表分為5-FU緩釋微粒植入組和對照組。植入組在肝癌切除術(shù)中將緩釋5-FU微粒600mg植入肝創(chuàng)面。全部患者術(shù)后均定期隨訪。 結(jié)果： (一)MTT(tetrazolium salt,噻唑藍(lán))法檢測植入用緩釋5-FU抑制人肝癌細(xì)胞生長的實驗 1.HepG2細(xì)胞經(jīng)植入用緩釋5-FU處理,可見部分細(xì)胞變圓、變鈍,細(xì)胞體積變小,伴核固縮,細(xì)胞由貼壁脫落,懸浮于培養(yǎng)液中,尤以浸泡21天和28天后的處理24h

9、為甚；而對照組則細(xì)胞成片生長,飽滿舒展,貼壁并少有脫落。 2.MTT檢測結(jié)果顯示,植入用緩釋5-FU釋放后第0d,第1d,第7d,第14d,第21d和第28d的培養(yǎng)液處理HepG2細(xì)胞72h后,細(xì)胞存活率分別為99.5％±8.2％、78.3％±6.2％、43.2％±4.5％、26.3％±3.2％、14.7％±2.2％和11.6％±1.5％。植入用緩釋5-FU以時間依賴性方式抑制肝癌細(xì)胞生長。 (二)植入用緩釋5-FU誘導(dǎo)

10、肝癌細(xì)胞凋亡的實驗研究 1.用Hochest染色觀察到隨著緩釋5-FU釋放時間的延長,凋亡細(xì)胞數(shù)目也隨之增加,其變化趨勢同MTT的結(jié)果基本一致。 2.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示,隨著緩釋5-FU釋放時間的延長,早期凋亡細(xì)胞數(shù)依次為0％、1.19％、2.26％、3.69％、4.92％和17.92％；呈逐漸升高趨勢,壞死和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)依次為0.10％、1.33％、3.77％、4.95％、6.27％和9.35％；總凋亡數(shù)依次為0

11、.10％、2.52％、6.03％、8.64％、11.17％和27.27％,也呈逐漸升高趨勢。 (三)肝癌行肝臟切除術(shù)中植入緩釋5-FU的臨床試驗 植入組術(shù)后2、3年腫瘤復(fù)發(fā)率分別為14.0％和23.3％,與對照組23.3％和34.7％比較(0.01(P<0.05);4、5年腫瘤復(fù)發(fā)率分別為32.0％和43.3％與對照組47.3％和59.3％比較(P<0.01)有統(tǒng)計學(xué)意義；植入組的5年生存率明顯高于對照組(P<0.01)

12、。 結(jié)論： (一)MTT檢測結(jié)果顯示,植入用緩釋5-FU可以在28天內(nèi)持續(xù)釋放,并且緩釋5-FU以時間依賴性方式抑制肝癌細(xì)胞生長。 (二)Hochest染色從形態(tài)學(xué)角度直觀地觀察到緩釋5-FU以時間依賴性方式導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的凋亡增加。 (三)流式細(xì)胞儀檢測到緩釋5-FU隨著釋放時間的延長對HepG2細(xì)胞凋亡比例增加。 (四)肝癌行肝切除術(shù)中植入緩釋5-FU不良反應(yīng)輕微,安全、簡便、有效,在-定