三種實驗動物臂叢神經(jīng)根撕脫傷后nNOS基因在脊髓表達的區(qū)域特異性.pdf

1、臂叢神經(jīng)是上肢神經(jīng)的總源，臂叢根性撕脫傷是最嚴重的創(chuàng)傷，可造成上肢感覺、運動功能部分或全部喪失，臨床上很難治愈，屬于世界難題，深入進行相關的臨床和基礎研究十分必要。目前基礎研究重點探求臂叢根性撕脫傷誘導運動神經(jīng)元死亡及其手術(shù)修復臂叢神經(jīng)再生的分子機制，尋找臂叢撕脫傷相關的信號通路及相關基因。包括本課題組在內(nèi)的許多研究證實，撕脫誘導運動神經(jīng)元死亡與一氧化氮合酶(NOS)的表達，特別是神經(jīng)元型NOS(nNOS)的表達有密切聯(lián)系。本課題組前期

2、的研究發(fā)現(xiàn)，臂叢撕脫后相應脊髓組織nNOS表達與運動神經(jīng)元死亡在常用的嚙齒類實驗動物中均存在種屬差異。SD大鼠、金黃地鼠及BALb/C小鼠損傷脊髓節(jié)段的nNOS mRNA表達下降，但nNOS蛋白表達只在大鼠降低，在金黃地鼠和小鼠都是升高的。這與我們前期形態(tài)學觀察的結(jié)果不一致。鑒于以上nNOS蛋白及mRNA取自損傷節(jié)段的全脊髓，形態(tài)學觀察到的nNOS和神經(jīng)元的死亡主要發(fā)生在根性撕脫傷損傷的前角，我們推測，脊髓損傷側(cè)及對照側(cè)，更精確地說是損

3、傷和對照側(cè)前、后角對根性撕脫傷的反應不一致。據(jù)此，本實驗從臂叢根性撕脫傷特異表現(xiàn)的nNOS基因和運動神經(jīng)元凋亡兩個層面，研究損傷和對照側(cè)前、后角四個脊髓區(qū)域?qū)λ好搨磻目臻g差異，以期為靶向定位地干預臂叢根性撕脫傷的進程，提供詳實的實驗依據(jù)。
　　 一、臂叢神經(jīng)根撕脫傷誘導脊髓運動神經(jīng)元死亡形式的種屬差異
　　 目的：我們前期研究發(fā)現(xiàn)撕脫傷誘導運動神經(jīng)元死亡數(shù)目存在種屬差異。本實驗進一步從nNOS，c-jun，caspa

4、se-3的分子表現(xiàn)以及運動神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，研究運動神經(jīng)元死亡方式是否也存在種屬差異。方法：用改良手術(shù)方法建立雄性成年SD大鼠，金黃地鼠和BALb/C小鼠全臂叢神經(jīng)根撕脫傷動物模型。在撕脫傷后3天和14天，用nNOS，c-jun，caspase-3免疫熒光、NADPH-d酶組織化學檢測前角運動神經(jīng)元內(nèi)上述分子表達差異，用透射電鏡觀察損傷運動神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果：①損側(cè)前角運動神經(jīng)元的存活率為，撕脫后3天，SD大鼠90.13％，金黃

5、地鼠79.46％，BALb/C小鼠71.46％。撕脫傷后14天，SD大鼠80.57％，金黃地鼠53.29％，BALb/C小鼠35.64％。各時間點兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。②撕脫傷后14天損傷運動神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)：SD大鼠及金黃地鼠的異染色質(zhì)增多，核膜皺褶并內(nèi)陷，線粒體輕度腫脹，神經(jīng)纖維輕度腫脹。BALb/C小鼠Golgi復合體腫脹，擴張，大量呈空泡狀，線粒體明顯腫脹，許多呈空泡狀，髓鞘板層狀結(jié)構(gòu)消失。③撕脫傷后14天c

6、aspase-3表達：三種鼠僅損側(cè)陽性運動神經(jīng)元明顯，且SD大鼠及金黃地鼠損側(cè)caspase-3與nNOS共表達于運動神經(jīng)元。BALb/C小鼠損傷運動神經(jīng)元只有少許呈現(xiàn)caspase-3陽性且不表達nNOS。④損側(cè)前角c-jun陽性運動神經(jīng)元數(shù)目：三種鼠撕脫傷后14天均小于損傷后3天，SD大鼠及金黃地鼠c-jun和nNOS共表達于損側(cè)前角運動神經(jīng)元中。小結(jié)：臂叢根性撕脫傷誘導大鼠和金黃地鼠運動神經(jīng)元可能死于凋亡，而小鼠運動神經(jīng)元死于壞死

7、。
　　 二、不同種屬臂叢神經(jīng)根撕脫傷后nNOS-mRNA表達的區(qū)域特異性
　　 目的：研究臂叢撕脫傷誘導nNOS的表達是否存在時空特異性，本實驗在mRNA水平對三種鼠nNOS基因進行時間空間特異性的檢測。方法：三種實驗動物組，各組分為臂叢根性撕脫傷后1h、3h、12h、24h、3d及14d，處死動物，將脊髓組織分為損傷側(cè)和對照側(cè)，RT-PCR檢測nNOS mRNA表達的時間曲線。選取3d及14d關鍵時間點，將脊髓組織分

8、為損傷側(cè)前后角和對照側(cè)前后角四個部分，檢測nNOS-mRNA表達的空間特異性。結(jié)果：①SD大鼠及金黃地鼠臂叢撕脫傷后各時間點對照側(cè)脊髓無明顯變化，損傷側(cè)脊髓nNOSmRNA先降低，3d后升高，到14d達到頂峰。而BALb/C小鼠損傷側(cè)nNOS mRNA升高，24 h達峰值，之后逐漸下降。②撕脫傷后3天，SD大鼠及金黃地鼠損傷側(cè)前角nNOSmRNA較對照側(cè)前角下降，而BALb/C小鼠則高于對照側(cè)前角，P均＜0.05。SD大鼠及金黃地鼠損傷

9、側(cè)后角nNOS mRNA表達量都下降，但與對照側(cè)后角相比，僅金黃地鼠有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。小鼠后角nNOS mRNA表達量無明顯變化(P＞0.05)。③撕脫傷后14天，SD大鼠及金黃地鼠損傷側(cè)前角nNOS mRNA表達量增加顯著高于對照側(cè)前角(P均＜0.001)。BALb/C小鼠損傷側(cè)前角nNOS-mRNA表達低于對照側(cè)前角(P＜0.001)。三種鼠損傷側(cè)后角nNOS mRNA表達量均較對照側(cè)后角少，但僅金黃地鼠的差異有顯著性

10、意義(P＜0.05)。小結(jié)：撕脫傷誘導nNOSmRNA表達的時空特異性存在種屬差異。
　　 三、不同種屬臂叢神經(jīng)根撕脫傷后nNOS-protein表達的區(qū)域特異性
　　 目的：用Western Blot檢測方法繼續(xù)從蛋白質(zhì)水平研究臂叢撕脫傷后nNOS蛋白的時空特異性，進而從各種不同分子水平上對臂叢神經(jīng)根撕脫傷后nNOS基因表達的時空特異性進行全面闡述。方法：實驗分為三種實驗動物組，各組分為臂叢根性撕脫傷后3d及14d，取

11、材，將脊髓組織分為損傷側(cè)和對照側(cè)，WesternBlot檢測nNOS protein，再將臂叢撕脫傷后3d及14d的脊髓組織分為損傷側(cè)前后角和對照側(cè)前后角，四個部分，通過Western Blot進行nNOS-protein的檢測。NADPH-d染色，caspase-3及c-jun同nNOS分別進行免疫熒光雙標檢測，對nNOS表達差異做進一步分析。結(jié)果：①撕脫后3天，較之對照側(cè)脊髓組織，SD大鼠和金黃地鼠損傷側(cè)nNOS蛋白表達下降，BAL

12、b/C小鼠明顯升高，P均＜0.05；撕脫后14天，較之對照側(cè)脊髓組織，SD大鼠和金黃地鼠損傷側(cè)nNOS蛋白表達明顯升高。小鼠則大幅的下降，P均＜0.05。②撕脫后3天，SD大鼠及金黃地鼠損傷側(cè)前角nNOS蛋白較對照側(cè)前角少(P＜0.01)，BALb/C小鼠損傷側(cè)前角nNOS蛋白則顯著高于對照側(cè)(P＜0.01)。三種鼠損傷側(cè)后角nNOS蛋白表達均下降，金黃地鼠及BALb/C小鼠的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。③撕脫后14天，SD大鼠

13、和金黃地鼠損傷側(cè)前角nNOS蛋白表達較之對照側(cè)前角升高，BALb/C則下降，P均＜0.001。三種鼠損傷側(cè)后角nNOS蛋白均較對側(cè)下降，小鼠下降的最明顯(P＜0.001)，其次是金黃地鼠(P均＜0.01)，SD大鼠無顯著性差異(P=0.775)。小結(jié)：撕脫傷誘導的三種鼠各自的nNOS蛋白與mRNA表達的時空特異性一致，三種鼠間存在種屬差異。損側(cè)前角：大鼠和金黃地鼠基本一致，先降后升；小鼠則先升后降；損側(cè)后角：小鼠和金黃地鼠持續(xù)下降，大鼠

14、下降不顯著。
　　 結(jié)論：
　　 1、臂叢根性撕脫傷誘導脊髓前角運動神經(jīng)元死亡存在種屬差異：在SD大鼠和金黃地鼠呈現(xiàn)凋亡，BALb/C小鼠則為壞死。
　　 2、臂叢根性撕脫傷誘導三種鼠脊髓組織nNOS基因表達，在nNOS mRNA和蛋白質(zhì)水平的改變規(guī)律一致。
　　 3、臂叢根性撕脫傷后脊髓組織nNOS基因在損傷側(cè)表達存在空間差異：SD大鼠與金黃地鼠的nNOS在mRNA和蛋白水平表達的變化為先降后升；小鼠則