三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臂叢神經(jīng)根撕脫傷后nNOS基因在脊髓表達(dá)的區(qū)域特異性.pdf

1、臂叢神經(jīng)是上肢神經(jīng)的總源，臂叢根性撕脫傷是最嚴(yán)重的創(chuàng)傷，可造成上肢感覺、運(yùn)動(dòng)功能部分或全部喪失，臨床上很難治愈，屬于世界難題，深入進(jìn)行相關(guān)的臨床和基礎(chǔ)研究十分必要。目前基礎(chǔ)研究重點(diǎn)探求臂叢根性撕脫傷誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡及其手術(shù)修復(fù)臂叢神經(jīng)再生的分子機(jī)制，尋找臂叢撕脫傷相關(guān)的信號(hào)通路及相關(guān)基因。包括本課題組在內(nèi)的許多研究證實(shí)，撕脫誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡與一氧化氮合酶(NOS)的表達(dá)，特別是神經(jīng)元型NOS(nNOS)的表達(dá)有密切聯(lián)系。本課題組前期

2、的研究發(fā)現(xiàn)，臂叢撕脫后相應(yīng)脊髓組織nNOS表達(dá)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡在常用的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中均存在種屬差異。SD大鼠、金黃地鼠及BALb/C小鼠損傷脊髓節(jié)段的nNOS mRNA表達(dá)下降，但nNOS蛋白表達(dá)只在大鼠降低，在金黃地鼠和小鼠都是升高的。這與我們前期形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果不一致。鑒于以上nNOS蛋白及mRNA取自損傷節(jié)段的全脊髓，形態(tài)學(xué)觀察到的nNOS和神經(jīng)元的死亡主要發(fā)生在根性撕脫傷損傷的前角，我們推測(cè)，脊髓損傷側(cè)及對(duì)照側(cè)，更精確地說是損

3、傷和對(duì)照側(cè)前、后角對(duì)根性撕脫傷的反應(yīng)不一致。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)從臂叢根性撕脫傷特異表現(xiàn)的nNOS基因和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡兩個(gè)層面，研究損傷和對(duì)照側(cè)前、后角四個(gè)脊髓區(qū)域?qū)λ好搨磻?yīng)的空間差異，以期為靶向定位地干預(yù)臂叢根性撕脫傷的進(jìn)程，提供詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、臂叢神經(jīng)根撕脫傷誘導(dǎo)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡形式的種屬差異
　　 目的：我們前期研究發(fā)現(xiàn)撕脫傷誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡數(shù)目存在種屬差異。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從nNOS，c-jun，caspa

4、se-3的分子表現(xiàn)以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，研究運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡方式是否也存在種屬差異。方法：用改良手術(shù)方法建立雄性成年SD大鼠，金黃地鼠和BALb/C小鼠全臂叢神經(jīng)根撕脫傷動(dòng)物模型。在撕脫傷后3天和14天，用nNOS，c-jun，caspase-3免疫熒光、NADPH-d酶組織化學(xué)檢測(cè)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)上述分子表達(dá)差異，用透射電鏡觀察損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果：①損側(cè)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率為，撕脫后3天，SD大鼠90.13％，金黃

5、地鼠79.46％，BALb/C小鼠71.46％。撕脫傷后14天，SD大鼠80.57％，金黃地鼠53.29％，BALb/C小鼠35.64％。各時(shí)間點(diǎn)兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。②撕脫傷后14天損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)：SD大鼠及金黃地鼠的異染色質(zhì)增多，核膜皺褶并內(nèi)陷，線粒體輕度腫脹，神經(jīng)纖維輕度腫脹。BALb/C小鼠Golgi復(fù)合體腫脹，擴(kuò)張，大量呈空泡狀，線粒體明顯腫脹，許多呈空泡狀，髓鞘板層狀結(jié)構(gòu)消失。③撕脫傷后14天c

6、aspase-3表達(dá)：三種鼠僅損側(cè)陽(yáng)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元明顯，且SD大鼠及金黃地鼠損側(cè)caspase-3與nNOS共表達(dá)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。BALb/C小鼠損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元只有少許呈現(xiàn)caspase-3陽(yáng)性且不表達(dá)nNOS。④損側(cè)前角c-jun陽(yáng)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目：三種鼠撕脫傷后14天均小于損傷后3天，SD大鼠及金黃地鼠c-jun和nNOS共表達(dá)于損側(cè)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中。小結(jié)：臂叢根性撕脫傷誘導(dǎo)大鼠和金黃地鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可能死于凋亡，而小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死于壞死

7、。
　　 二、不同種屬臂叢神經(jīng)根撕脫傷后nNOS-mRNA表達(dá)的區(qū)域特異性
　　 目的：研究臂叢撕脫傷誘導(dǎo)nNOS的表達(dá)是否存在時(shí)空特異性，本實(shí)驗(yàn)在mRNA水平對(duì)三種鼠nNOS基因進(jìn)行時(shí)間空間特異性的檢測(cè)。方法：三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組，各組分為臂叢根性撕脫傷后1h、3h、12h、24h、3d及14d，處死動(dòng)物，將脊髓組織分為損傷側(cè)和對(duì)照側(cè)，RT-PCR檢測(cè)nNOS mRNA表達(dá)的時(shí)間曲線。選取3d及14d關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，將脊髓組織分

8、為損傷側(cè)前后角和對(duì)照側(cè)前后角四個(gè)部分，檢測(cè)nNOS-mRNA表達(dá)的空間特異性。結(jié)果：①SD大鼠及金黃地鼠臂叢撕脫傷后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照側(cè)脊髓無(wú)明顯變化，損傷側(cè)脊髓nNOSmRNA先降低，3d后升高，到14d達(dá)到頂峰。而BALb/C小鼠損傷側(cè)nNOS mRNA升高，24 h達(dá)峰值，之后逐漸下降。②撕脫傷后3天，SD大鼠及金黃地鼠損傷側(cè)前角nNOSmRNA較對(duì)照側(cè)前角下降，而BALb/C小鼠則高于對(duì)照側(cè)前角，P均＜0.05。SD大鼠及金黃地鼠損傷

9、側(cè)后角nNOS mRNA表達(dá)量都下降，但與對(duì)照側(cè)后角相比，僅金黃地鼠有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。小鼠后角nNOS mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化(P＞0.05)。③撕脫傷后14天，SD大鼠及金黃地鼠損傷側(cè)前角nNOS mRNA表達(dá)量增加顯著高于對(duì)照側(cè)前角(P均＜0.001)。BALb/C小鼠損傷側(cè)前角nNOS-mRNA表達(dá)低于對(duì)照側(cè)前角(P＜0.001)。三種鼠損傷側(cè)后角nNOS mRNA表達(dá)量均較對(duì)照側(cè)后角少，但僅金黃地鼠的差異有顯著性

10、意義(P＜0.05)。小結(jié)：撕脫傷誘導(dǎo)nNOSmRNA表達(dá)的時(shí)空特異性存在種屬差異。
　　 三、不同種屬臂叢神經(jīng)根撕脫傷后nNOS-protein表達(dá)的區(qū)域特異性
　　 目的：用Western Blot檢測(cè)方法繼續(xù)從蛋白質(zhì)水平研究臂叢撕脫傷后nNOS蛋白的時(shí)空特異性，進(jìn)而從各種不同分子水平上對(duì)臂叢神經(jīng)根撕脫傷后nNOS基因表達(dá)的時(shí)空特異性進(jìn)行全面闡述。方法：實(shí)驗(yàn)分為三種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組，各組分為臂叢根性撕脫傷后3d及14d，取

11、材，將脊髓組織分為損傷側(cè)和對(duì)照側(cè)，WesternBlot檢測(cè)nNOS protein，再將臂叢撕脫傷后3d及14d的脊髓組織分為損傷側(cè)前后角和對(duì)照側(cè)前后角，四個(gè)部分，通過Western Blot進(jìn)行nNOS-protein的檢測(cè)。NADPH-d染色，caspase-3及c-jun同nNOS分別進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)，對(duì)nNOS表達(dá)差異做進(jìn)一步分析。結(jié)果：①撕脫后3天，較之對(duì)照側(cè)脊髓組織，SD大鼠和金黃地鼠損傷側(cè)nNOS蛋白表達(dá)下降，BAL

12、b/C小鼠明顯升高，P均＜0.05；撕脫后14天，較之對(duì)照側(cè)脊髓組織，SD大鼠和金黃地鼠損傷側(cè)nNOS蛋白表達(dá)明顯升高。小鼠則大幅的下降，P均＜0.05。②撕脫后3天，SD大鼠及金黃地鼠損傷側(cè)前角nNOS蛋白較對(duì)照側(cè)前角少(P＜0.01)，BALb/C小鼠損傷側(cè)前角nNOS蛋白則顯著高于對(duì)照側(cè)(P＜0.01)。三種鼠損傷側(cè)后角nNOS蛋白表達(dá)均下降，金黃地鼠及BALb/C小鼠的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。③撕脫后14天，SD大鼠

13、和金黃地鼠損傷側(cè)前角nNOS蛋白表達(dá)較之對(duì)照側(cè)前角升高，BALb/C則下降，P均＜0.001。三種鼠損傷側(cè)后角nNOS蛋白均較對(duì)側(cè)下降，小鼠下降的最明顯(P＜0.001)，其次是金黃地鼠(P均＜0.01)，SD大鼠無(wú)顯著性差異(P=0.775)。小結(jié)：撕脫傷誘導(dǎo)的三種鼠各自的nNOS蛋白與mRNA表達(dá)的時(shí)空特異性一致，三種鼠間存在種屬差異。損側(cè)前角：大鼠和金黃地鼠基本一致，先降后升；小鼠則先升后降；損側(cè)后角：小鼠和金黃地鼠持續(xù)下降，大鼠

14、下降不顯著。
　　 結(jié)論：
　　 1、臂叢根性撕脫傷誘導(dǎo)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡存在種屬差異：在SD大鼠和金黃地鼠呈現(xiàn)凋亡，BALb/C小鼠則為壞死。
　　 2、臂叢根性撕脫傷誘導(dǎo)三種鼠脊髓組織nNOS基因表達(dá)，在nNOS mRNA和蛋白質(zhì)水平的改變規(guī)律一致。
　　 3、臂叢根性撕脫傷后脊髓組織nNOS基因在損傷側(cè)表達(dá)存在空間差異：SD大鼠與金黃地鼠的nNOS在mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化為先降后升；小鼠則