雙氫青蒿素通過非p38 MAPK通路抑制VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移.pdf

1、背景：
　　青蒿是一年生菊科植物黃花蒿(AretemisiaannuaL.)的干燥地上部分。70年代，我國科研人員首次從黃花蒿葉中提取分離有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯藥物，命名為青蒿素(Artemisinin，ART)。青蒿素主要衍生物包括雙氫青蒿素(Aihydroartemisinin，DHA)、蒿甲醚(Artemether，AM)、蒿乙醚(Arteether, AE)、青蒿琥酯(Artesunate，AS)。青蒿素及其衍生物具有高效

2、、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，被世界衛(wèi)生組織推薦為高效安全的重要抗瘧藥。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物除了顯著的抗瘧療效外，還具有很強(qiáng)的抗炎、抗腫瘤、抗真菌、抗血管生成等作用。其中，其抗血管新生作用越來越受到人們重視，但具體作用機(jī)制尚不明確。
　　動脈粥樣硬化性心血管疾病(Arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)是造成人類死亡率最高的疾病之一。大約有75％急性冠脈事

3、件和60％有癥狀的頸動脈疾病和動脈粥樣硬化斑塊破裂有關(guān)。動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生是決定斑塊生長、易損、破裂的重要因素。在缺氧、缺血、炎癥等條件下，細(xì)胞分泌VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子等激活臨近的內(nèi)皮細(xì)胞，原有血管管腔擴(kuò)張，通透性增加，分泌金屬蛋白酶等降解基底細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖。內(nèi)皮細(xì)胞分泌膠原蛋白，內(nèi)皮細(xì)胞重構(gòu)，新生血管形成。
　　斑塊內(nèi)血管新生與斑塊發(fā)展程度、斑塊的易損性密切相關(guān)。新生血管常位于斑塊

4、內(nèi)炎性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤區(qū)和動脈粥樣硬化斑塊薄纖維帽的肩部，易發(fā)生破裂、血管栓塞。
　　形態(tài)異常和出血是易損斑塊新生血管的主要特征。新生血管，管壁脆弱，容易破裂、滲漏。大量紅細(xì)胞外滲不僅直接引起壞死核心擴(kuò)大、管腔閉塞，而且紅細(xì)胞膜富含膽固醇，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集，巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞活化，釋放VEGF和金屬蛋白酶，促進(jìn)粥樣斑塊內(nèi)新生血管形成和繼發(fā)斑塊內(nèi)出血，導(dǎo)致惡性循環(huán)。
　　動脈粥樣硬化性心血管疾病是一種慢性炎性疾

5、病，在斑塊的發(fā)展中許多促血管生成途徑都被重新激活，形成不成熟的新生血管，導(dǎo)致斑塊破裂出血，血栓形成，急性事件發(fā)生。因此，抑制斑塊內(nèi)血管新生對防治動脈粥樣硬化心血管疾病具有重要意義。
　　目前抗血管新生藥物按照作用靶點(diǎn)的不同主要分為酪氨酸激酶抑制劑，核酸抑制劑，VEGF抑制劑，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑，非特異性血管生成抑制劑和天然中草藥物。酪氨酸激酶抑制劑研究較為成熟，占主要的優(yōu)勢。然而多數(shù)酪氨酸激酶抑制劑對多種

6、酪氨酸激酶靶點(diǎn)均有抑制作用，在抗腫瘤活性的同時產(chǎn)生高血壓，蛋白尿，傷口愈合不良等多種不良反應(yīng)。發(fā)展選擇性高、耐受性好、副作用少的的新生血管抑制劑成為研究趨勢。
　　內(nèi)皮細(xì)胞遷移是血管新生的重要組成部分。內(nèi)皮細(xì)胞在趨化、趨觸、機(jī)械等刺激作用產(chǎn)生的定向移動，形成遷移。
　　VEGF是目前最強(qiáng)的血管生長因子，在內(nèi)皮細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用。與其受體結(jié)合后，引起受體自身磷酸化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移。同時VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖

7、溶酶原激活劑，降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，增加血管通透性，為血管新生提供條件。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路構(gòu)成一個大的級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)包括細(xì)胞遷移的多種生理過程。p38MAPK通路是MAPK重要的亞族之一，其將VEGF信號傳達(dá)至微絲，誘導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架重排調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移。通過對細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)，p38 MAPK在血管新生發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
　　雙氫青蒿素是青蒿素C10羥基還

8、原半合成青蒿素衍生物。與其他藥物相比，雙氫青蒿素是一種有效的，水溶性的，具有較少副作用的抗瘧藥，具有較強(qiáng)的抗血管新生作用。
　　目前關(guān)于信號傳導(dǎo)通路對雙氫青蒿素作用內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響國內(nèi)外尚未見報道。
　　目的：
　　我們假設(shè)雙氫青蒿素通過p38 MAPK通路抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移。探討p38 MAPK信號通路在雙氫青蒿素作用內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用，為雙氫青蒿素抑制動脈粥樣硬化易損斑塊血管新生提供理論指導(dǎo)。

9、　　研究方法：
　　1.Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):
　　取對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞消化后離心，成1×105單細(xì)胞懸液，接種到24孔Transwell上層小室中。分為DHA加藥組、DHA+SB203850加藥組和空白對照組，在DHA和SB203850組分別加入20uM DHA和20uMSB203850，在下層小室中加入500μl含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基與20ng/mlVEGF。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。<

10、br>　　2.劃痕愈合實(shí)驗(yàn):
　　將長勢良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種在在24孔板中，加入100ng/ml VEGF，待細(xì)胞數(shù)長至70％左右，24孔板底部形成致密單層細(xì)胞層時，用無菌吸管尖端作劃痕。DHA組加入20μM DHA，SB203850組加入20uM SB203850; DHA+SB203850組加入20uM DHA，20uM SB203850;放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，0h，6h，12h，24h觀察細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)及生長趨勢變

11、化。
　　3.Western Blot分析
　　對數(shù)期生長的人臍靜脈細(xì)胞胰酶消化后調(diào)整濃度為2.5×105個/孔接種至六孔板，加入濃度為100ng/ml的VEGF。分為八組，待細(xì)胞增殖達(dá)70-80％時，茴香素組加入p38 MAPK激動劑茴香素。0.5h、1h、2h、6h、12h、24h DHA組加入20uM DHA，提取蛋白。Western Blot分析p38 MAPK信號通路蛋白總p38、磷酸化p38蛋白水平變化。

12、　　4.細(xì)胞電子阻抗傳感系統(tǒng)分析
　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于8孔ECIS電極板上，分為DHA組，SB203850+DHA組，SB203850組和空白對照組。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞直接在電極上面生長形成單層細(xì)胞層。分別給予40 kHz的高電壓脈沖30秒電擊，導(dǎo)致部分細(xì)胞損傷、死亡從電極脫落。在DHA組加入20uM DHA，SB203850+ DHA組加入20uM DHA，20uMSB203850，SB203850組加入20uMSB20385

13、0，監(jiān)控內(nèi)皮細(xì)胞愈合修復(fù)過程，記錄0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h電阻的變化。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0軟件處理分析。組間比較采用配對t檢驗(yàn)，所有試驗(yàn)均至少重復(fù)3次，檢驗(yàn)的顯著性水平定義為α=0.05，P＜0.05為存在顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1.雙氫青蒿素抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移
　　Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)表明DHA

14、組與對照組相比，內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(33.76％，P＜0.01)。8h后觀察細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DHA組內(nèi)皮細(xì)胞的遷移入劃痕區(qū)域明顯減少(40.97％，p＜0.01)。細(xì)胞電子阻抗傳感系統(tǒng)(ElectricCell-Substrate Impedance Sensing，ECIS)傷痕愈合實(shí)驗(yàn)中2h后DHA組內(nèi)皮細(xì)胞阻抗較對照組明顯減少。隨著時間延長，阻抗差值逐漸增大。4h，8h，12h DHA組與對照組比較，DHA組阻抗值明顯減

15、低(4h p＜0.05、8h p＜0.05，12h p＜0.01)。
　　2.Western-blot檢測p38 MAPK信號通路蛋白的表達(dá)沒有顯著變化
　　與對照組相比，茴香霉素組磷酸化p38 MAPK蛋白水平顯著增高(P＜0.05)，DHA組0.5h，1h，2h，6h，12h，24h磷酸化p38 MAPK蛋白水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。茴香霉素組、對照組、0.5h，1h，2h，6h，12h，24h DHA組總p3

16、8 MAPK蛋白水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)。
　　3.p38MAPK通路抑制劑SB203850對雙氫青蒿素抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移沒有影響
　　Transwell小孔遷移實(shí)驗(yàn)顯示SB203850組與DHA+SB203850組比較，DHA+SB203850組內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P＜0.01);DHA+SB203850組與DHA組比較，DHA+SB203850組內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　劃

17、痕實(shí)驗(yàn)中SB203850組與DHA+SB203850組比較，DHA+SB203850組明顯內(nèi)皮細(xì)胞遷移劃痕區(qū)域面積明顯減少(P＜0.05);DHA+SB203850組與DHA組比較，DHA+SB203850組減少的劃痕面積略高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　ECIS傷痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示DHA對內(nèi)皮細(xì)胞遷移抑制的時效關(guān)系。與空白對照組相比，DHA組、SB203850組、DHA+SB203850組在2h阻抗值開始降低。隨著時間的延長，DHA組、

18、SB203850組、DHA+SB203850組阻抗值逐漸降低，12h時阻抗差異最明顯。DHA+SB203850組阻抗值＜SB203850組阻抗值＜DHA組阻抗值＜空白對照組阻抗值。SB203850組與DHA+SB203850組比較，DHA+SB203850組阻抗值明顯減低，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4h p＜0.05、8h p＜0.01，12h p＜0.05)。DHA組與DHA+SB203850組相比，4h，8h，12h兩組間阻抗值減少百分比均

19、無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　雙氫青蒿素抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移獨(dú)立于p38 MAPK信號通路。
　　意義
　　1.本研究首次探討信號通路對雙氫青蒿素作用內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響機(jī)制，證實(shí)雙氫青蒿素獨(dú)立于p38 MAPK信號傳導(dǎo)通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，為雙氫青蒿素抑制動脈粥樣硬化易損斑塊血管新生提供理論依據(jù)。
　　2.本課題引用國際先進(jìn)的細(xì)胞電子阻抗傳感動態(tài)分析系統(tǒng)，能夠?qū)崟r、定量監(jiān)測內(nèi)皮細(xì)胞傷痕愈合