雌激素對骨質(zhì)疏松癥易感基因AHSG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：
　　α2-Heremans-Schmid糖蛋白(α2-Heremans-Schmid-glycoprotein，AHSG)基因于肝臟特異性表達，其編碼合成的產(chǎn)物又稱胎球蛋白A(fetuin-A)，是一種分泌型糖蛋白，對骨代謝及礦化起重要調(diào)節(jié)作用:一方面AHSG促進鈣磷等礦物質(zhì)在骨膠原纖維網(wǎng)內(nèi)礦化，另一方面抑制心血管等其它組織的異位礦化。因此，AHSG對骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生其保護作用，AHSG是骨質(zhì)疏松癥的重要易感基因。

2、　　雌激素撤退是女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要原因之一，然而其具體機制尚不清楚。有研究表明不同AHSG基因型的婦女，腰椎及股骨頸的骨密度(bonemineral density，BMD)也明顯不同。絕經(jīng)后婦女血漿AHSG水平下降，行雌激素治療后AHSG水平又回升。因此，雌激素很可能通過調(diào)節(jié)AHSG基因表達而影響AHSG水平。而雌激素對AHSG基因的調(diào)節(jié)作用以及相關(guān)機制還沒有被闡明。
　　本研究中，我們通過動物模型及培養(yǎng)細胞驗證雌激

3、素對AHSG基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，利用熒光素酶報告基因載體及其它分子生物學實驗具體分析雌激素調(diào)節(jié)AHSG基因轉(zhuǎn)錄的可能機制，為揭示AHSG基因?qū)琴|(zhì)疏松癥，尤其是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病提供新的理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1、利用卵巢切除的(oophorectomized，OVX) Wistar骨質(zhì)疏松大鼠建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，并設(shè)立假手術(shù)對照組。
　　2、采集大鼠血、尿，解剖分離肝臟及股骨。骨質(zhì)疏松參數(shù)選擇及測定如

4、下:全自動生化分析儀測定尿鈣、血鈣及血磷等離子;三點彎曲試驗法檢測股骨的機械力學;雙能X線骨密度儀測定股骨干的礦物質(zhì)含量。
　　3、ELISA檢測大鼠血清Ahsg水平。提取大鼠肝臟中RNA和蛋白質(zhì)，Real-timePCR和Western blot檢測Ahsg的表達。
　　4、培養(yǎng)人肝癌細胞系HepG2細胞，轉(zhuǎn)染ERα表達載體，施加100 nM E2刺激，或與雌激素抑制劑100 nM ICI182780、轉(zhuǎn)錄抑制劑2.5μg

5、/ml放線菌素D共同孵育。應(yīng)用ELISA，Real-time PCR和Western blot檢測AHSG的表達。
　　5、擴增-1554/+53 AHSG啟動子區(qū)域，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體，并進行系列截短，與ERα載體共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，施加E2刺激，檢測熒光素酶活性，尋找雌激素敏感的AHSG啟動子區(qū)域。
　　6、提取的HepG2細胞核蛋白，電泳遷移實驗(electrophoresis mobility shiftas

6、say，EMSA)鑒定-1488/-1482 AP-1反應(yīng)元件。染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，CHIP)，re-ChIP,和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)分析ERα和c-Jun/c-Fos在-1488/-1482 AP-1結(jié)合位點處的相互作用。
　　7、以特異性的MAPK抑制劑10μM PD98059預(yù)處理E2/ERα作用的HepG2細胞，或轉(zhuǎn)染M

7、EK1激活MAPK信號通路，Western blot檢測c-Jun、c-Fos、及AHSG的表達，評估MAPK途徑在雌激素誘導(dǎo)AP-1和AHSG表達的過程中的作用。
　　結(jié)果：
　　1、OVX大鼠血鈣、血磷及尿鈣濃度增加、骨礦物質(zhì)含量及機械強度明顯下降，上述參數(shù)均提示OVX大鼠呈現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松表型。與假手術(shù)對照組相比，血清AHSG水平明顯下降，肝臟AHSG mRNA及蛋白的表達也明顯降低。
　　2、與對照組相比，用E

8、2/ERα處理的HepG2細胞AHSGmRNA升高了1.6倍，且能夠被ICI182，780或放線菌素D所抑制。同時其AHSG蛋白表達也明顯升高，且能夠被ICI182，780所抑制。
　　3、AHSG啟動子-熒光素酶報告基因檢測提示不同截短的AHSG啟動子活性不同，-1500pAHSG-LUC載體對E2/ERα的反應(yīng)最明顯。進一步截短丟失-1488/-1482AP-1反應(yīng)元件后，失去了對E2/ERα的反應(yīng)性。
　　4、EMSA

9、發(fā)現(xiàn)HepG2細胞的核提取物與野生型-1488/-1482AP-1寡核苷酸探針形成特異性結(jié)合帶，E2/ERα增強了結(jié)合帶信號，且該結(jié)合帶可被冷探針抑制，加入AP-1抗體形成超阻滯(supershif)，突變型探針沒有結(jié)合帶。
　　5、ChIP表明HepG2細胞的核提取物分別與c-Jun，c-Fos和ERα抗體免疫沉淀后，PCR擴增AHSG-1488/-1482 AP-1反應(yīng)元件的啟動子區(qū)域呈陽性。c-Jun，c-Fos抗體免疫復(fù)合

10、物再次與ERα抗體進行免疫沉淀的re-ChIP試驗，仍有特異性擴增。Real-time PCR定量發(fā)現(xiàn)E2/ERα處理增加了c-Jun，c-Fos和ERα與AHSG啟動子區(qū)的結(jié)合。
　　6、Co-IP發(fā)現(xiàn)HepG2細胞的核提取物與c-Jun抗體免疫沉淀后，能夠與ERα抗體Western blot得出陽性結(jié)合帶，反之亦然，c-Jun與ERα的結(jié)合可以被E2/ERα加強。
　　7、E2/ERα處理增加了HepG2細胞AP-1的表

11、達豐度。MAPK信號通路特異性抑制劑PD98059處理阻斷了E2/ERα對AP-1及AHSG表達的上調(diào)作用，轉(zhuǎn)染特異性MEK1激活MAPK通路后，加強了E2/ERα對AP-1及AHSG的表達上調(diào)作用。
　　結(jié)論：
　　1、AHSG的轉(zhuǎn)錄與表達在OVX骨質(zhì)疏松大鼠及HepG2細胞中都存在雌激素反應(yīng)性。
　　2、雌激素通過ERα與c-Jun/c-Fos形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，結(jié)合于AHSG啟動子-1488/-1482 AP-1反應(yīng)