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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
α2-Heremans-Schmid糖蛋白(α2-Heremans-Schmid-glycoprotein,AHSG)基因于肝臟特異性表達(dá),其編碼合成的產(chǎn)物又稱胎球蛋白A(fetuin-A),是一種分泌型糖蛋白,對(duì)骨代謝及礦化起重要調(diào)節(jié)作用:一方面AHSG促進(jìn)鈣磷等礦物質(zhì)在骨膠原纖維網(wǎng)內(nèi)礦化,另一方面抑制心血管等其它組織的異位礦化。因此,AHSG對(duì)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生其保護(hù)作用,AHSG是骨質(zhì)疏松癥的重要易感基因。
2、 雌激素撤退是女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要原因之一,然而其具體機(jī)制尚不清楚。有研究表明不同AHSG基因型的婦女,腰椎及股骨頸的骨密度(bonemineral density,BMD)也明顯不同。絕經(jīng)后婦女血漿AHSG水平下降,行雌激素治療后AHSG水平又回升。因此,雌激素很可能通過(guò)調(diào)節(jié)AHSG基因表達(dá)而影響AHSG水平。而雌激素對(duì)AHSG基因的調(diào)節(jié)作用以及相關(guān)機(jī)制還沒(méi)有被闡明。
本研究中,我們通過(guò)動(dòng)物模型及培養(yǎng)細(xì)胞驗(yàn)證雌激
3、素對(duì)AHSG基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,利用熒光素酶報(bào)告基因載體及其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)具體分析雌激素調(diào)節(jié)AHSG基因轉(zhuǎn)錄的可能機(jī)制,為揭示AHSG基因?qū)琴|(zhì)疏松癥,尤其是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病提供新的理論依據(jù)。
材料與方法:
1、利用卵巢切除的(oophorectomized,OVX) Wistar骨質(zhì)疏松大鼠建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型,并設(shè)立假手術(shù)對(duì)照組。
2、采集大鼠血、尿,解剖分離肝臟及股骨。骨質(zhì)疏松參數(shù)選擇及測(cè)定如
4、下:全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿鈣、血鈣及血磷等離子;三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)法檢測(cè)股骨的機(jī)械力學(xué);雙能X線骨密度儀測(cè)定股骨干的礦物質(zhì)含量。
3、ELISA檢測(cè)大鼠血清Ahsg水平。提取大鼠肝臟中RNA和蛋白質(zhì),Real-timePCR和Western blot檢測(cè)Ahsg的表達(dá)。
4、培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染ERα表達(dá)載體,施加100 nM E2刺激,或與雌激素抑制劑100 nM ICI182780、轉(zhuǎn)錄抑制劑2.5μg
5、/ml放線菌素D共同孵育。應(yīng)用ELISA,Real-time PCR和Western blot檢測(cè)AHSG的表達(dá)。
5、擴(kuò)增-1554/+53 AHSG啟動(dòng)子區(qū)域,構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體,并進(jìn)行系列截短,與ERα載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,施加E2刺激,檢測(cè)熒光素酶活性,尋找雌激素敏感的AHSG啟動(dòng)子區(qū)域。
6、提取的HepG2細(xì)胞核蛋白,電泳遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoresis mobility shiftas
6、say,EMSA)鑒定-1488/-1482 AP-1反應(yīng)元件。染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,CHIP),re-ChIP,和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)分析ERα和c-Jun/c-Fos在-1488/-1482 AP-1結(jié)合位點(diǎn)處的相互作用。
7、以特異性的MAPK抑制劑10μM PD98059預(yù)處理E2/ERα作用的HepG2細(xì)胞,或轉(zhuǎn)染M
7、EK1激活MAPK信號(hào)通路,Western blot檢測(cè)c-Jun、c-Fos、及AHSG的表達(dá),評(píng)估MAPK途徑在雌激素誘導(dǎo)AP-1和AHSG表達(dá)的過(guò)程中的作用。
結(jié)果:
1、OVX大鼠血鈣、血磷及尿鈣濃度增加、骨礦物質(zhì)含量及機(jī)械強(qiáng)度明顯下降,上述參數(shù)均提示OVX大鼠呈現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松表型。與假手術(shù)對(duì)照組相比,血清AHSG水平明顯下降,肝臟AHSG mRNA及蛋白的表達(dá)也明顯降低。
2、與對(duì)照組相比,用E
8、2/ERα處理的HepG2細(xì)胞AHSGmRNA升高了1.6倍,且能夠被ICI182,780或放線菌素D所抑制。同時(shí)其AHSG蛋白表達(dá)也明顯升高,且能夠被ICI182,780所抑制。
3、AHSG啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)提示不同截短的AHSG啟動(dòng)子活性不同,-1500pAHSG-LUC載體對(duì)E2/ERα的反應(yīng)最明顯。進(jìn)一步截短丟失-1488/-1482AP-1反應(yīng)元件后,失去了對(duì)E2/ERα的反應(yīng)性。
4、EMSA
9、發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞的核提取物與野生型-1488/-1482AP-1寡核苷酸探針形成特異性結(jié)合帶,E2/ERα增強(qiáng)了結(jié)合帶信號(hào),且該結(jié)合帶可被冷探針抑制,加入AP-1抗體形成超阻滯(supershif),突變型探針沒(méi)有結(jié)合帶。
5、ChIP表明HepG2細(xì)胞的核提取物分別與c-Jun,c-Fos和ERα抗體免疫沉淀后,PCR擴(kuò)增AHSG-1488/-1482 AP-1反應(yīng)元件的啟動(dòng)子區(qū)域呈陽(yáng)性。c-Jun,c-Fos抗體免疫復(fù)合
10、物再次與ERα抗體進(jìn)行免疫沉淀的re-ChIP試驗(yàn),仍有特異性擴(kuò)增。Real-time PCR定量發(fā)現(xiàn)E2/ERα處理增加了c-Jun,c-Fos和ERα與AHSG啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。
6、Co-IP發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞的核提取物與c-Jun抗體免疫沉淀后,能夠與ERα抗體Western blot得出陽(yáng)性結(jié)合帶,反之亦然,c-Jun與ERα的結(jié)合可以被E2/ERα加強(qiáng)。
7、E2/ERα處理增加了HepG2細(xì)胞AP-1的表
11、達(dá)豐度。MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑PD98059處理阻斷了E2/ERα對(duì)AP-1及AHSG表達(dá)的上調(diào)作用,轉(zhuǎn)染特異性MEK1激活MAPK通路后,加強(qiáng)了E2/ERα對(duì)AP-1及AHSG的表達(dá)上調(diào)作用。
結(jié)論:
1、AHSG的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)在OVX骨質(zhì)疏松大鼠及HepG2細(xì)胞中都存在雌激素反應(yīng)性。
2、雌激素通過(guò)ERα與c-Jun/c-Fos形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,結(jié)合于AHSG啟動(dòng)子-1488/-1482 AP-1反應(yīng)
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