Rictor在肺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移中的功能研究.pdf

1、目的:
　　 Rictor是新近發(fā)現(xiàn)的蛋白,對(duì)其與mTOR復(fù)合所形成的mTORC2的功能目前研究甚少。趨化運(yùn)動(dòng)在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中起重要作用。本研究將Rictor(mTORC2)與腫瘤細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)聯(lián),應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)降低肺癌細(xì)胞中Rictor的表達(dá)水平,探討其對(duì)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,初步明確Rictor在肺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)中的作用機(jī)制。同時(shí),力求從中找到新的靶點(diǎn),并有針對(duì)性的設(shè)計(jì)有效的抗癌藥物。
　　

2、方法:
　　 1.用免疫組化的方法檢測(cè)Rictor在肺癌組織中的表達(dá)情況,統(tǒng)計(jì)分析Rictor表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　 2.應(yīng)用StealthTMRNA降低肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中Rictor蛋白的表達(dá)水平,用WesternBlotting技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)。
　　 3.采用MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)Rictor降表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 4.用趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rict

3、or降表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力影響。
　　 5.用黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rictor降表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附能力的影響。
　　 6.用肌動(dòng)蛋白聚合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGF刺激不同時(shí)間后Rictor降表達(dá)引起的肌動(dòng)蛋白聚合的變化,采用磷酸化特異性抗體檢測(cè)Rictor降表達(dá)對(duì)EGF刺激后肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白cofilin磷酸化水平的影響。
　　 7.用WesternBlotting檢測(cè)Rictor降表達(dá)后其下游信號(hào)分子Akt的活

4、化程度。用免疫熒光的方法檢測(cè)Rictor與PKCζ在細(xì)胞中的定位情況,觀察在EGF刺激后,它們的分布變化；并用WesternBlotting方法檢測(cè)Rictor降表達(dá)對(duì)PKCζ活化程度的影響,進(jìn)一步明確Rictor在調(diào)控肺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)中的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.Rictor在肺腺癌組織中高表達(dá)(陽(yáng)性率55％),與患者年齡、性別、吸煙與否、TNM分期之間并無(wú)顯著的相關(guān)性,但與腫瘤患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P

5、<0.05)。
　　 2.Rictor表達(dá)陽(yáng)性的患者預(yù)后不良,三年生存率僅為13.6％。
　　 3.應(yīng)用StealthTMRNA轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞后,Western檢測(cè)Rictor蛋白表達(dá)明顯下降。
　　 4.Rictor降表達(dá)減慢A549細(xì)胞的增殖(P<0.001),細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)在G1期細(xì)胞的比例升高。
　　 5.與對(duì)照組相比,Rictor降表達(dá)的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的趨化

6、運(yùn)動(dòng)能力比對(duì)照組細(xì)胞明顯減弱(P<0.001)。
　　 6.與對(duì)照組相比,Rictor降表達(dá)的A549細(xì)胞黏附能力減弱(P<0.001)。
　　 7.與對(duì)照組相比,Rictor降表達(dá)的A549細(xì)胞F-actin聚合減少；并且經(jīng)Western證實(shí),降低Rictor表達(dá)能夠明顯減低與F-actin聚合和解聚相關(guān)蛋白cofilin的磷酸化水平。
　　 8.Rictor降表達(dá)阻斷Akt在Ser473位點(diǎn)的磷酸化；而且EG

7、F刺激后Rictor和PKCζ在細(xì)胞膜上出現(xiàn)共定位,降低Rictor表達(dá)減弱了PKCζ的活化程度。
　　 結(jié)論:
　　 1.Rictor在肺腺癌組織中過(guò)表達(dá)與患者發(fā)生早期轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。
　　 2.Rictor參與調(diào)控了EGF誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移。Rictor是通過(guò)調(diào)節(jié)cofilin的活化來(lái)調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞骨架重排的。
　　 3.Rictor是Akt和PKCζ的上游信號(hào)分子。Rictor是通過(guò)Akt/