反義TrxS基因在小麥中的表達(dá)、生理生化作用與抗穗發(fā)芽特性的研究.pdf

1、小麥穗發(fā)芽是一種世界性的氣候?yàn)?zāi)害，它嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量、品質(zhì)和種用價(jià)值。籽粒內(nèi)α-淀粉酶活性升高是引起穗發(fā)芽的重要原因之一，硫氧還蛋白(ThioredoxinTrx)以還原靶蛋白的二硫鍵而對(duì)蛋白質(zhì)酶、淀粉酶活性等起著重要的調(diào)節(jié)作用。為此，本課題組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將反義TrxS基因?qū)胄←溒贩N895004和揚(yáng)麥5號(hào)，并對(duì)轉(zhuǎn)基因株系T1～T3代進(jìn)行了分子檢測(cè)和遺傳分析，獲得了00T89和00TY5轉(zhuǎn)基因后代。為了進(jìn)一步探明外源基因在后代群體中

2、的遺傳規(guī)律，確定反義TrxS基因在轉(zhuǎn)基因小麥后代中的表達(dá)及其作用。本研究繼續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)基因后代株系在DNA水平上進(jìn)行分子檢測(cè)，分析了籽粒形成和萌發(fā)過(guò)程中目的基因在RNA水平上的轉(zhuǎn)錄及mRNA豐度的變化；系統(tǒng)研究了籽粒成熟、后熟及發(fā)芽過(guò)程中Trxh活性及相關(guān)酶活性的變化規(guī)律，以及這些活性物質(zhì)引起碳氮代謝的變化；對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了人工模似降雨條件下的穗發(fā)芽和籽粒發(fā)芽檢驗(yàn)；并對(duì)轉(zhuǎn)基因的植株性狀和品質(zhì)特性進(jìn)行了分析，主要研究結(jié)果如下： 1轉(zhuǎn)基

3、因株系目的基因的分子檢測(cè)、遺傳分析和除草劑(Bialaphos)抗性檢測(cè) 利用分子檢測(cè)手段，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系00T89和00TY5的T4～T6代植株在DNA水平上進(jìn)行了目的基因的特異性擴(kuò)增，并對(duì)T6代株系進(jìn)行除草劑Bialaphos的抗性檢測(cè)。結(jié)果表明：各代株系PCR和nested-PCR檢測(cè)結(jié)果均出現(xiàn)了與特異性引物擴(kuò)增相符合的亮帶，PCR產(chǎn)物Southern雜交證實(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果具有特異性和真實(shí)性。T4代70％～80％株系中陽(yáng)性植

4、株與陰性植株比例為7：1(χ2=1.238)；T5代各株系均出現(xiàn)了陰性植株的比例增大；T6代株系陽(yáng)/陰植株比例又增加，00T89的比例為12：1(χ2=3.816)，00TY5的為10：1(χ2=3.61)。通過(guò)目的基因的檢測(cè)篩選，已獲得穩(wěn)定遺傳的純合的轉(zhuǎn)基因株系。此外，T6代轉(zhuǎn)基因株系對(duì)除草劑Bialaphos均表現(xiàn)出非抗性，與對(duì)照無(wú)明顯區(qū)別，表明共轉(zhuǎn)化的bar基因在目的基因的多代篩選中已被剔除。 2反義TrxS基因在籽粒中的

5、基因表達(dá)及其生理生化作用 2.1mRNA豐度和Trxh活性變化以actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)進(jìn)行RT-PCR分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，反義TrxS基因?qū)?nèi)源硫氧還蛋白基因的表達(dá)具有明顯的抑制作用，Trx基因轉(zhuǎn)錄量減弱，密度掃描結(jié)果表明，61.5％陽(yáng)性株系在籽粒萌發(fā)時(shí)mRNA豐度比對(duì)照顯著降低(P＜0.01)，蠟熟期00T89和00TY5籽粒mRNA豐度分別比對(duì)照下降25.8％和42.8％。Trx基因轉(zhuǎn)錄量降低導(dǎo)致籽粒中硫氧還蛋白活性下降，體外進(jìn)行硫

6、氧還蛋白的活性反應(yīng)呈現(xiàn)“S”曲線，轉(zhuǎn)基因籽粒的活性反應(yīng)速度遲緩，作用強(qiáng)度下降，并且在籽粒成熟、后熟和發(fā)芽過(guò)程中Trxh活性也一直低于對(duì)照，以開花后30d二者差異最大，轉(zhuǎn)基因比對(duì)照降低了29.3％(P＜0.01)。 2.2淀粉酶活性和淀粉含量、組分及可溶性糖的變化轉(zhuǎn)基因籽粒α-淀粉酶活性在開花后30d至成熟后10d比照極顯著降低(P＜0.01)；β-淀粉酶活性在成熟前平均比對(duì)照下降26.65％(P＜0.01)，成熟后差異變小(P＞

7、0.05)；而脫支酶活性在后熟過(guò)程中平均與對(duì)照降低27.63％(P＜0.01)。發(fā)芽過(guò)程中，三種酶均有升高趨勢(shì)，α-淀粉酶在發(fā)芽初期(48h內(nèi))迅速上升，β-淀粉酶和脫支酶在發(fā)芽后期(48h以后)上升較快，但轉(zhuǎn)基因籽粒三種酶活性在發(fā)芽48h內(nèi)均顯著低于對(duì)照(P＜0.05)，發(fā)芽48h后抑制作用減弱。轉(zhuǎn)基因籽粒支鏈淀粉和總淀粉含量比對(duì)照增加5.6和7.0個(gè)百分點(diǎn)，可溶性糖含量比對(duì)照降低14.2％。發(fā)芽過(guò)程中轉(zhuǎn)基因籽粒可溶性糖增加緩慢，發(fā)芽

8、4d可溶性糖的含量?jī)H為對(duì)照的73.2％。 2.3蛋白酶活性及蛋白質(zhì)含量、組分、結(jié)構(gòu)、亞基的變化反義TrxS基因的轉(zhuǎn)入直接影響到籽粒中氮代謝過(guò)程。轉(zhuǎn)基因籽粒蛋白酶活性在籽粒后熟過(guò)程中比對(duì)照極顯著降低68.1％(P＜0.01)。發(fā)芽過(guò)程中，蛋白酶的活性呈直線上升，但對(duì)照籽粒蛋白酶的活性上升速度是轉(zhuǎn)基因的2倍，在這個(gè)過(guò)程中蛋白質(zhì)的含量變化與蛋白酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(-0.880，P＜0.01)。轉(zhuǎn)基因與對(duì)照籽粒中總蛋白質(zhì)含量的差異不顯著

9、，但清蛋白含量明顯增加，比對(duì)照提高了15.0％。蛋白組分中巰基含量下降，尤其是代謝活性蛋白巰基含量在開花后30d至成熟后5d比對(duì)照極顯著減少。谷蛋白亞基SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，成熟和后熟期轉(zhuǎn)基因籽粒譜帶強(qiáng)度明顯高于對(duì)照，光密度掃描結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因分別比對(duì)照高出29.7％和55.5％。籽粒發(fā)芽4d時(shí)，轉(zhuǎn)基因比對(duì)照籽粒中高分子量醇溶蛋白亞基和谷蛋白亞基數(shù)量多，且譜帶強(qiáng)度高于對(duì)照，醇溶蛋白亞基和谷蛋白亞基光密度總和分別比對(duì)照高出30.77

10、％和37.95％。可見，反義TrxS基因的導(dǎo)入，阻礙了發(fā)芽過(guò)程中貯藏蛋白的分解調(diào)運(yùn)，并首先保護(hù)了醇溶蛋白和谷蛋白高分子量區(qū)域的亞基不被水解。 3人工氣候室和模擬降雨條件下轉(zhuǎn)基因株系穗發(fā)芽抗性研究 穗發(fā)芽和籽粒發(fā)芽試驗(yàn)表明，00TY5的6個(gè)株系和00T89的6個(gè)株系與對(duì)照相比表現(xiàn)出明顯的穗發(fā)芽抗性，而且在開花后30d至成熟后10d，這些抗性株系在穗開始發(fā)芽時(shí)間、穗粒發(fā)芽率、穗發(fā)芽度、籽粒發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)方面均與對(duì)照達(dá)極顯著

11、的差異，成熟后25d，各株系的發(fā)芽參數(shù)與對(duì)照差異減少。相關(guān)分析表明，穗發(fā)芽參數(shù)與籽粒發(fā)芽參數(shù)呈極顯著的相關(guān)關(guān)系。mRNA豐度與穗發(fā)芽參數(shù)呈顯著和極顯著的相關(guān)性。說(shuō)明反義TrxS基因表達(dá)對(duì)穗發(fā)芽的抑制作用。 4轉(zhuǎn)反義TrxS基因小麥株系植株性狀和品質(zhì)性狀分析 對(duì)轉(zhuǎn)基因株系農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的研究分析表明，轉(zhuǎn)基因株系在生育進(jìn)程和生育期方面與對(duì)照同步。00T89株系平均株高比對(duì)照增加了3.8cm，00TY5與對(duì)照差異不大。單穗

12、粒數(shù)比對(duì)照平均增加23.3％，單株成穗數(shù)和千粒重與對(duì)照無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)基因籽粒的淀粉及組分、清蛋白和賴氨酸的含量上升，淀粉的糊化特性參數(shù)高于對(duì)照。發(fā)芽籽粒的糊化參數(shù)明顯降低，且峰值粘度與籽粒發(fā)芽率的相關(guān)性達(dá)5％顯著水平，表明較高的粘度具有較強(qiáng)的籽粒發(fā)芽抗性。 綜上所述，本研究在跟蹤檢測(cè)反義TrxS基因遺傳規(guī)律、獲得轉(zhuǎn)基因純合株系的基礎(chǔ)上，首次探明了反義TrxS基因在RNA水平上作用的原初性機(jī)制，系統(tǒng)分析了轉(zhuǎn)基因籽粒形成、后熟和發(fā)芽