前列腺癌外周血微轉(zhuǎn)移的免疫磁珠分選和分子生物學檢測.pdf

1、目的： 1、探討建立一種特異性和敏感性較高的免疫磁珠分選檢測前列腺癌循環(huán)腫瘤細胞的方法，以利于發(fā)現(xiàn)早期前列腺癌隱匿性微轉(zhuǎn)移，評估前列腺癌的預后，監(jiān)測術后前列腺癌復發(fā)與轉(zhuǎn)移。 2、聯(lián)用免疫磁珠和實時熒光定量RT-PCR檢測前列腺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移，評價其在判斷前列腺癌外周血微轉(zhuǎn)移發(fā)生中的臨床應用價值。 方法： 1、體外培養(yǎng)前列腺癌LNCaP細胞，將其制成細胞懸液，細胞懸液和事先已與單克隆抗體(鼠抗人PSMA

2、單抗)預孵育的包被人抗鼠IgG抗體的磁珠作用，顯微鏡觀察其與免疫磁珠結(jié)合的情況，計算玫瑰花環(huán)形成率，并觀察其與不同濃度的單抗作用時的玫瑰花環(huán)形成率，摸索最佳反應條件。臺盼藍染色檢測分選前后癌細胞存活率。將LNCaP細胞分別與外周血單個核細胞(PBMC)及全血細胞混合，與預孵育的免疫磁珠作用，磁架分離，顯微鏡觀察，進行靈敏度的檢測。 2、本研究的臨床病例包括前列腺癌(PCa)組53例，年齡57～85歲，平均73歲，經(jīng)Jewett臨

3、床分期：B期7例，C期19例，D期27例：經(jīng)Gleason病理分級：高分化癌12例，中分化癌18例，低分化癌23例；良性前列腺增生(BPH)組30例，年齡35～88歲，平均68歲；正常對照組5例。 3、采集前列腺癌和BPH患者及正常對照組外周血5ml于EDTA-K2抗凝的真空管中，分離單個核細胞，應用已經(jīng)建立的免疫磁珠檢測外周血微轉(zhuǎn)移前列腺癌細胞的方法學進行分選，分選后的細胞提取RNA，應用實時熒光定量RT-PCR方法檢測PSA

4、mRNA來鑒定分選結(jié)果，從而判斷患者外周血微轉(zhuǎn)移的存在與否。PSAmRNA的實時熒光定量RT-PCR檢測方法是本實驗室已經(jīng)建立的。本研究對聯(lián)用免疫磁珠和實時熒光定量RT-PCR判斷前列腺癌外周血微轉(zhuǎn)移發(fā)生的臨床應用價值進行了分析評價。 結(jié)果： 1、成功建立免疫磁珠法檢測外周血微轉(zhuǎn)移前列腺癌細胞的方法學。隨著PSMA單克隆抗體濃度的增高，LNCaP細胞與免疫磁珠的結(jié)合率也增高。當單抗?jié)舛葹?μg/ml時，結(jié)合率最高，玫瑰花

5、環(huán)形成率可達到90％，單抗?jié)舛壤^續(xù)增加，二者結(jié)合率不再升高并略有下降。且分選后癌細胞存活率較之分選前未明顯改變。該方法敏感性高，當PBMC與LNCaP細胞比例為106:1時可以檢測到癌細胞，檢測靈敏度可達20個腫瘤細胞/ml外周血。 2、臨床病例檢測結(jié)果：5例正常對照者中未檢測到陽性結(jié)果；30例BPH患者中檢測到1例陽性；53例前列腺癌患者中有23例陽性，陽性率43.4％，其中ECT證實的27例骨轉(zhuǎn)移癌患者中，有17例陽性，陽性