IVF-ET患者卵泡液有效成分對NK細胞功能的影響.pdf

1、近年來，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及衍生輔助生殖技術在臨床和實驗室領域都取得了很大發(fā)展。在該技術的應用中，人們對卵細胞在體內的生存環(huán)境——卵泡液進行了全面多方位的研究分析，以求為卵細胞的體外培養(yǎng)創(chuàng)造最適生長條件，進一步提高移植胚胎種植妊娠率。在超促排卵過程中由于注射大劑量的超促排卵藥物，患者體內各種激素水平相應升高，從而卵母細胞生長的局部環(huán)境及整個機體內環(huán)境都發(fā)生變化。卵泡液內含有多種濃度不同的激素、生長因子和細胞因子，直接影響

2、生殖細胞的增殖、細胞分裂能力、分裂數(shù)量和生存時間，并進而影響胚胎生長發(fā)育。卵泡液中的細胞因子的含量，激素水平的高低，與患者的年齡，卵巢對藥物的反應性及儲備功能密切相關。NK細胞是一類具有自發(fā)的細胞毒活性的細胞，是一類非常重要的免疫調節(jié)細胞，通過釋放淋巴因子對機體免疫功能進行調節(jié)，無須抗原刺激即可介導抗腫瘤和抗病毒功能。NK細胞即是天然免疫的主要承擔者，又是獲得性細胞免疫的核心調節(jié)細胞，其生物學功能受多種細胞因子的調節(jié)。近來研究發(fā)現(xiàn)卵巢內

3、的一些細胞因子對NK細胞的活性有增強或抑制的作用，而且NK細胞可能與胚胎著床、發(fā)育以及胎盤的形成有關，但作用機制尚不清楚，特別是罕有從NK細胞發(fā)揮殺傷作用的角度進行研究的報告。本實驗以30例IVF-ET患者的卵泡液為研究對象，通過檢測其對NK細胞殺傷活性的影響，為進一步了解卵泡液的組成成分奠定基礎。 實驗材料和方法 卵泡液采集：隨機選擇在沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心進行IVF-ET治療的不孕癥患者，共30例。卵泡成熟時穿

4、刺取卵，留取第一管無明顯血染的卵泡液。以3 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于冷凍管中，投入液氮罐保存?zhèn)溆谩Ｊ占涗浕颊叩哪挲g、獲卵數(shù)，按年齡將患者分成2組(高齡組：≥35歲，9人；年輕組：<35歲，21人)。效應細胞的制備：無菌抽取枸櫞酸鈉抗凝的正常人外周靜脈血100ml，5％BSA-D-Hank’s液將血液等倍稀釋，用淋巴細胞分離液分離PBSC細胞，20℃離心2000r/min，20min。吸取中間白色絮狀細胞層，用

5、5％BSA-D-Hank’s液洗滌處理，棄上清。去紅細胞處理，重復離心洗滌兩次。將獲得的細胞用臺盼藍染色，確定細胞活力>95％，計數(shù)后，將PBSC細胞調成濃度為2×10<'7>/ml細胞懸液備用。 靶細胞的制備：取對數(shù)生長的K<,562>細胞，1200r/min離心8min，棄上清，加人5％BSA-RPMI-1640液洗滌兩次。將獲得的細胞用臺盼藍染色，確定細胞活力>95％，計數(shù)后，用5％BSA-RPMI-1640液將靶細胞調成

6、濃度為2×10<'5>/ml細胞懸液備用。 NK細胞活性的測定采用乳酸脫氫酶釋放法，在96孔板中按測定目的加人PBSC細胞、K<,562>細胞、卵泡液、5％BSA-RPMI-1640液，1％NP-40,同時設最大釋放孔，自然釋放孔，NK細胞活性對照孔。孵育培養(yǎng)后加入LDH底物液，終止反應后用酶標儀(λ=570nm)讀取OD值并計算NK細胞殺傷活性：NK細胞殺傷活性(％)=(實驗組OD值-自然釋放對照孔OD值)/(最大釋放孔OD值

7、-自然釋放孔對照孔OD值)×100％ 統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據以均數(shù)表示，用t檢驗進行顯著性分析，相關性實驗結果 不同濃度的IVF-ET患者卵泡液對正常人外周血NK細胞殺傷活性有顯著影響。當效靶細胞比為100：1時，4倍稀釋的IVF-ET患者卵泡液對NK細胞殺傷活性有增強作用，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)；8倍稀釋的IVF-ET患者卵泡液對NK細胞殺傷活性也有增強作用，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)；且兩組

8、不同稀釋濃度的IVF-ET患者卵泡液對NK細胞殺傷活性的影響相比較，差異也有顯著性(P<0.01)。高齡組和年輕組患者4倍稀釋的卵泡液對NK細胞殺傷活性影響，二者無顯著差異(P>0.05)；高齡組和年輕組患者8倍稀釋的卵泡液對NK細胞殺傷活性影響，二者無顯著差異(P>0.05)。4倍稀釋的IVF-ET患者卵泡液對NK細胞殺傷活性影響與其該周期獲卵數(shù)無相關性(P>0.05)；8倍稀釋的IVF-ET患者卵泡液對NK細胞殺傷活性影響與其該周

9、期獲卵數(shù)無相關性(P>0.05)。卵泡是由卵母細胞及其周圍的顆粒細胞層和卵泡膜細胞層構成，卵泡中含有多種對卵細胞生長發(fā)育、卵母細胞成熟及排卵有調節(jié)作用的激素及細胞因子，各種細胞因子與卵巢功能密切相關，并具有特異性受體，參與一系列生殖過程，并對卵巢甾體激素的分泌有重要調節(jié)作用。其中一部分激素及細胞因子如雌激素、孕激素、白介素-1，2，6、干擾素、腫瘤壞死因子、胰島素樣生長因子-1、轉化生長因子、表皮生長因子等與免疫調節(jié)作用密切相關，發(fā)揮了

10、重要功能。 自然殺傷細胞(NK)具有分泌細胞因子和細胞毒效應，同時NK細胞的殺傷活性也受多種細胞因子的調控，它門的主要功能是在細胞免疫，在腫瘤免疫、抗病毒感染中均起到重要的作用。NK細胞與妊娠有著密切關系，在正常未孕子宮內膜存在，妊娠后是子宮內膜中增加最明顯的免疫職能細胞，其高度表達穿孔素為早孕期間滋養(yǎng)層細胞侵人蛻膜提供幫助，且分泌多種細胞因子，形成一個網絡，彼此協(xié)調，在母胎界面的免疫調節(jié)中NK細胞發(fā)揮重要作用，某些機制可能與惡

11、性腫瘤的入侵有相似之處。 本實驗結果證明IVF-ET超促排卵周期中患者卵泡液總體上對NK細胞殺傷活性有增強作用，對該結果擬從兩方面進行分析：(1)NK細胞能識別區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞，因而能發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。目前NK細胞與調控細胞靶細胞和調控分子(如識別受體的配體)的相互作用采用的方法均不是單細胞或單分子的行為觀察，亦無法達到實時動態(tài)的目的，更多反映的是復雜生物體系的整體反應，而非具體連續(xù)的觀察。NK細胞生命活動集中于特異性受體

12、識別，NK細胞活化涉及諸多識別信號的整和，主要包括識別受體和細胞因子受體兩大類。兩大類受體中又各自含有識別性受體和活化類受體，這些因素的總和將決定NK細胞是發(fā)揮免疫監(jiān)視功能，還是使NK細胞活化處于抑制狀態(tài)以利用腫瘤或病原體逃逸。NK細胞抑制受體(KiUer cell inhibitory receptor，KIR)和NK細胞激活受體(Killer cell activa-ting receptor，KAR)在機體的免疫監(jiān)視功能中發(fā)揮極

13、其重要的作用。在同一細胞上表達的KIR與KAR相互協(xié)調，在正常情況下，抑制性信號占主導地位，避免正常自身細胞被NK細胞殺傷；如傳遞激活性信號在NK細胞的信號傳遞過程中占主要地位，可導致表達靶細胞被殺傷，提示MHC分子可能主要表達在一些非正常的細胞上。本實驗NK細胞殺傷活性的增強是其表達的各種受體與相應的配體受卵泡液內各種激素及細胞因子作用后，KAR在免疫監(jiān)視中占優(yōu)勢地位的結果。(2)NK細胞對腫瘤的殺傷優(yōu)勢表現(xiàn)為直接溶解和分泌細胞因子兩

14、個方面，NK細胞可以產生TNF-α、IFN-γ和IL-1，這些細胞因子在NK細胞抗癌反應中有十分重要地位。其中IFN-γ在thl型免疫反應的形成過程中發(fā)揮著重要作用，可活化巨噬細胞并使其分泌細胞因子，在這兩種免疫效應細胞間形成正反饋回路。研究發(fā)現(xiàn)卵泡液中存在著IL-1活性物質及TNF，因此我們認為這些細胞因子在一定程度上參與了NK細胞發(fā)揮殺傷活性的作用過程。 不同年齡組患者卵泡液對NK細胞殺傷活性影響無顯著差異，從分析其原因可能

15、是因為由于年齡因素不同造成的卵巢生殖內分泌功能不同所引起的卵泡液成分不同對NK細胞殺傷功能影響的確沒有差異。也可能由于年齡不同造成卵泡液微環(huán)境內增強及抑制NK細胞殺傷活性的成分均發(fā)生變化，但二者的作用互相抵消，因此在總體上對NK細胞殺傷活性的影響沒有差異。 不同患者的卵泡液對NK細胞殺傷活性的影響與其獲卵數(shù)之間無相關性。分析患者該周期因卵巢反應性不同所引起的卵泡生長發(fā)育及成熟，以及連帶引起的卵泡液內激素水平及細胞因子水平不同對N

16、K細胞殺傷活性影響無相關關系。 在此基礎上，計劃下一步對卵泡液中的各種成分含量做以檢測，以了解它們在對NK細胞殺傷活性的影響中扮演的具體角色。這對開發(fā)與卵泡液有關的產品，研究抗腫瘤藥物及胚胎特異相關避孕藥以及提高動物的繁殖，提高人類輔助生殖技術的成功率有重要意義。 1.IVF-ET周期患者卵泡液對正常人外周血中NK細胞的殺傷活性有增強作用，而且不同濃度IVF-ET周期患者卵泡液對NK細胞殺傷活性的影響有顯著差異。