5-HT及其受體在異氟烷麻醉—覺醒調(diào)節(jié)中的作用及機制.pdf

1、自1846年乙醚被成功應(yīng)用于手術(shù)麻醉起，才真正誕生了現(xiàn)代意義上的手術(shù)外科學(xué)。在其后的100多年間，多種新型麻醉藥物相繼問世。時至今日,全球每年有近2億人接受不同類型的手術(shù)治療，其中的絕大多數(shù)都需要接受麻醉，麻醉的使用范圍越來越廣。然而，全麻藥物是如何發(fā)揮麻醉效應(yīng)，實現(xiàn)可逆性意識消失(Loss of Consciousness，LOC)的，卻一直未得到合理解釋。這一問題已成為外科麻醉界和神經(jīng)科學(xué)界一個倍受關(guān)注的研究課題。2005年Scie

2、nce雜志更是將“How do general anesthetics work?”列入了當(dāng)今人類亟待解決的125個重要科學(xué)問題之一。
　　已有研究證實，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是大腦中，存在多個與全麻機制相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，包括被廣泛認(rèn)為促麻醉和睡眠的GABA能系統(tǒng)和促麻醉覺醒的orexin能系統(tǒng)，然而這兩個系統(tǒng)是如何相互作用的至今仍不清楚。5-羥色胺（5-HT）是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，存在于胃腸道嗜鉻細胞、血小板和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在中

3、樞由5-HT能神經(jīng)元合成。以往實驗已證明5-HT在生理睡眠與覺醒中發(fā)揮重要作用，但是對5-HT究竟是促睡眠還是促覺醒，目前還沒有一致結(jié)論，我們分析可能和5-HT不同亞型的受體作用有關(guān)，但是目前這方面還沒有系統(tǒng)的研究。另外，5-HT在麻醉-覺醒機制中的作用尚未被研究，本實驗試圖通過對5-HT及其受體的研究，觀察其在全身麻醉特別是蘇醒過程中的作用，并初步探索其作用機制。
　　實驗1
　　目的：通過側(cè)腦室注射的方法觀察5-HT及其

4、受體在異氟烷麻醉-覺醒調(diào)控中的作用。
　　方法：雄性SD大鼠（體重250-280g），按隨機分組法分為14組（I-XIV，n=6）。在2％戊巴比妥40-60mg/kg腹腔麻醉下，將微注射套管埋置于側(cè)腦室，并在顱骨表面固定。大鼠在術(shù)后休息5天后隔天進行一次異氟烷麻醉-覺醒實驗。將大鼠置入翻轉(zhuǎn)麻醉箱并給予1.5%的異氟烷麻醉,記錄麻醉誘導(dǎo)時間（翻正反射消失時間）。麻醉誘導(dǎo)成功后第15min，同一組大鼠前后三次實驗分別隨機給予5μL s

5、aline或兩種不同劑量的同一種5-HT/受體激動劑或拮抗劑（具體給藥試劑及劑量見表2），泵注時間5min。麻醉30min后（即給藥結(jié)束10 min后）停止異氟烷吸入，觀察大鼠翻正反射恢復(fù)時間，即異氟烷的麻醉覺醒時間。
　　結(jié)果: I組動物側(cè)腦室注射0.5umol5-HT后異氟烷麻醉的覺醒時間縮短（P<0.05），II組動物側(cè)腦室注射20μg5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT后異氟烷麻醉覺醒時間顯著縮短（P<0.01），II

6、I組動物側(cè)腦室注射50μg5-HT1A受體拮抗劑WAY100635后，異氟烷麻醉覺醒時間延長（P<0.001）。VI組動物側(cè)腦室注射5μg5-HT2A/C受體激動劑DOI后麻醉覺醒時間也縮短（P<0.05），VIII組動物側(cè)腦室注射25μg5-HT2C受體拮抗劑RS102221后麻醉覺醒延遲（P<0.05），其余組動物側(cè)腦室給予5-HT1B、2A、3A、6、7型受體激動劑和拮抗劑后對異氟烷麻醉覺醒無明顯影響（P>0.05）。
　　

7、實驗2
　　目的：通過Pef區(qū)微注射5-HT1A受體激動劑和拮抗劑研究其在異氟烷麻醉-覺醒調(diào)控中的作用和機制。
　　方法：
　　2.1觀察Pef區(qū)注射5-HT1A受體激動劑/拮抗劑對異氟烷麻醉大鼠誘導(dǎo)和覺醒時間的影響：SD大鼠（250-280g）隨機分為I、II兩組（n=6），先在Pef區(qū)放置微注射套管。5天后每組各進行三次異氟烷麻醉覺醒實驗，異氟烷吸入開始后先觀察誘導(dǎo)時間，大鼠翻正反射消失時間為誘導(dǎo)時間。而后，在麻醉

8、15 min后I組動物側(cè)腦室隨機注射0.3μLsaline、0.6或1.2μg5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT，II組動物側(cè)腦室隨機注射0.3ul saline、1.5或3.0μg5-HT1A受體拮抗劑WAY10635，觀察覺醒時間，翻正反射恢復(fù)時間為覺醒時間。
　　2.2Pef區(qū)注射5-HT1A受體激動劑/拮抗劑對異氟烷麻醉大鼠腦電的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機分為 I-III三組（n=6），先進行腦電監(jiān)測電

9、極及 Pef核團微注射套管埋置術(shù)，5天后進行腦電觀察實驗。將電極接入腦電檢測儀，記錄10min清醒狀態(tài)腦電波后，將大鼠放入0.75MAC異氟烷的翻轉(zhuǎn)箱40min后，I組Pef注射5μL saline，II組注射5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT1.2μg，III組注射5-HT1A受體拮抗劑WAY1006353.0μg，繼續(xù)記錄腦電波30min，比較給藥前后10min期間腦電圖的變化。2.3Pef區(qū)注射5-HT1A受體激動劑/拮抗劑

10、對異氟烷麻醉大鼠神經(jīng)元Fos表達的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機分為I-IV四組（n=6），實驗前在Pef核團行微注射套管埋置術(shù)，5天后I組大鼠心腔注射10%KCL處死后多聚甲醛灌注取腦。II、III、IV接受1.5%異氟烷麻醉第15min后Pef分別注射0.3ul saline、1.2μg5-HT1A受體激動劑8-OHDPAT和3.0μg5-HT1A受體拮抗劑WAY100635，麻醉第30min甲醛灌注取腦。所有腦塊切片后進

11、行 orexin和c-Fos免疫熒光雙標(biāo)染色，以觀察 Pef區(qū)域Orexin神經(jīng)元的活化狀態(tài)。
　　2.4Pef區(qū)注射5-HT1A受體激動劑/拮抗劑對異氟烷麻醉大鼠血中orexin水平的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機分為I-III三組（n=6）,先行Pef核團微注射套管埋置術(shù)，5天后進行放射免疫實驗。大鼠用1.5%異氟烷進行麻醉，仰臥固定于動物手術(shù)臺，將微注射管置入套管中。麻醉第15min三組分別泵入0.3μL sali

12、ne、1.2μg8-OH-DPAT和3.0μgWAY100635。于翻正反射消失時、麻醉第30min各從股靜脈抽取2ml靜脈血。提取血清后進行放射免疫實驗，測血清中orexin含量。
　　結(jié)果:Pef給予1.2μg5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT使異氟烷麻醉覺醒時間明顯延長（P<0.001）,而給予1.5μg和3.0μg5-HT1A受體拮抗劑WAY100635均使麻醉覺醒時間縮短（P<0.05，P<0.001）。1.2μg

13、8-OH-DPAT可使腦電波的δ波明顯減少，出現(xiàn)暴發(fā)性抑制，并使 Pef區(qū)域 c-FOS陽性 orexin神經(jīng)元數(shù)目比鹽水組明顯減少（P<0.05），外周靜脈血中Orexin含量降低（P<0.05），3.0μg WAY100635對0.75MAC異氟烷麻醉狀態(tài)下的大鼠的腦電波沒有明顯影響，但是可以使 c-Fos陽性的 Orexin神經(jīng)元數(shù)目增多（P<0.05）、外周血Orexin含量升高（P<0.05），產(chǎn)生與8-OH-DPAT相反的作

14、用。
　　實驗3
　　目的：探索VLPO區(qū)注射5-HT1A受體激動劑/拮抗劑對異氟烷麻醉覺醒時間的影響及其機制。
　　方法：
　　3.1VLPO區(qū)注射5-HT1A受體激動劑/拮抗劑對異氟烷麻醉大鼠覺醒時間的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機分為I、II兩組（n=6），實驗前先在VLPO區(qū)埋置微注射套管。5天后每組各進行三次異氟烷麻醉覺醒實驗。從異氟烷吸入開始，觀察動物的麻醉誘導(dǎo)時間。大鼠翻正反射消失時間為誘

15、導(dǎo)時間。麻醉后15 min后I組動物VLPO區(qū)注射0.3μLsaline、0.6或1.2μg5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT，II組動物VLPO區(qū)注射0.3μLsaline、1.5或3.0μg5-HT1A受體拮抗劑WAY10635，觀察大鼠的覺醒時間。翻正反射恢復(fù)時間為覺醒時間。
　　3.2VLPO區(qū)注射5-HT1A受體激動劑/拮抗劑對異氟烷麻醉大鼠腦電的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機分為I、II、III三組（n

16、=6），腦電監(jiān)測電極及VLPO核團微注射套管埋置術(shù)，5天后進行腦電觀察實驗。將電極接入腦電檢測儀，記錄10min清醒狀態(tài)腦電波，將大鼠放入0.75MAC異氟烷的翻轉(zhuǎn)箱40min。隨后5min內(nèi)，I組Pef注射5μLsaline，II組注射5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT1.2μg，III組注射5-HT1A受體拮抗劑WAY1006353.0μg，繼續(xù)記錄腦電波30min，比較給藥前后10min腦電波變化記錄給藥前后腦電圖變化。

17、r>　　3.3VLPO區(qū)注射5-HT1A受體激動劑/拮抗劑對異氟烷麻醉大鼠GABA神經(jīng)元Fos表達的影響：SD大鼠（250-280g）被隨機分為I-IV四組（n=6），實驗前在VLPO核團行微注射套管埋置術(shù)，5天后I組大鼠心腔注射10%KCL處死后多聚甲醛灌注取腦。II、III、IV接受1.5%異氟烷麻醉第15 min后VLPO分別注射0.3μL saline、1.2μg5-HT1A受體激動劑8-OHDPAT和3.0μg5-HT1A受體

18、拮抗劑WAY100635,麻醉第30min甲醛灌注取腦。所有腦塊切片后進行GABA和c-Fos免疫熒光雙標(biāo)染色，以觀察VLPO區(qū)域GABA神經(jīng)元的活化狀態(tài)。
　　結(jié)果：VLPO區(qū)注射1.2μg5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT后，異氟烷麻醉覺醒時間明顯縮短（P<0.05），而注射3.0μg其拮抗劑WAY100635使麻醉覺醒時間延長（P<0.05）。另外，8-OH-DPAT可以使0.75MAC異氟烷麻醉下的大鼠腦電波的δ波明

19、顯減少，出現(xiàn)類覺醒波，甚至發(fā)生覺醒的行為學(xué)表現(xiàn)。3.0μg WAY100635對大鼠腦電波形沒有明顯影響。免疫熒光試驗結(jié)果尚未完成。
　　小結(jié)：本研究中我們通過三個步驟的實驗，首先證明了側(cè)腦室注射5-HT的總體效應(yīng)是促進異氟烷麻醉大鼠的覺醒，并證明其作用可能是通過其1A和2C受體產(chǎn)生的；其次，和我們預(yù)想的結(jié)果相反，我們發(fā)現(xiàn)Pef區(qū)orexin神經(jīng)元的5-HT1A受體興奮，反而抑制了麻醉覺醒；最后，我們證明5-HT可以通過5-HT1