棉花查耳酮異構(gòu)酶對類黃酮合成及棉花生長發(fā)育的影響.pdf

1、陸地棉（Gossypium hirsutum）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，是人類獲取天然纖維的主要來源。類黃酮物質(zhì)（Flavonoids）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，參與植物組織顏色的形成、花粉發(fā)育、植物激素的運(yùn)輸以及抗逆反應(yīng)，在植物生長發(fā)育中具有非常重要的作用。查耳酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase,CHI,EC5.5.1.6)催化從查耳酮到黃烷酮的異構(gòu)反應(yīng)，是類黃酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。
　　為研究

2、查耳酮異構(gòu)酶對類黃酮合成及棉花生長發(fā)育的影響，本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，克隆了查耳酮異構(gòu)酶基因(GhCHI-A、GhCHI-D)，通過原核表達(dá)，分析了相應(yīng)蛋白的催化酶活特性；并進(jìn)一步通過在棉花（冀棉14，J14）中抑制和上調(diào)GhCHI-A基因的表達(dá)，研究了GhCHI在棉花類黃酮合成途徑中及生長發(fā)育中的作用。
　　主要結(jié)果如下：
　　1.陸地棉中存在兩個I型CHI蛋白
　　以擬南芥AtCHI基因為探針序列，在異源四

3、倍體陸地棉（AADD）基因組中查找同源序列，共獲得14個CHI同源蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，這14個蛋白分列于3類CHI蛋白，其中有2個（GhA_13G0197和GhD_13G0211）屬于I型CHI蛋白。這兩個CHI蛋白與I型CHI具有高度的序列相似性，具有完整的底物結(jié)合和活性中心保守氨基酸殘基，以及I型CHI蛋白的底物特異氨基酸殘基。這兩個基因在基因結(jié)構(gòu)和序列上均分別與亞洲棉（AA）和雷蒙德氏棉（DD）的同源基因接近，分別命名為GhC

4、HI-A和GhCHI-D。
　　通過qRT-RCR檢測了這兩個基因的表達(dá)水平，表明這兩個基因在棉花各個組織中均有一定程度的表達(dá)，其中在葉片和胚珠的表達(dá)水平最高，但在開花后20天和25天的纖維中幾乎沒有表達(dá)；進(jìn)一步分析表明，在生長階段的棉花葉片中（Half expansion leaf,HL）的表達(dá)水平較高。
　　2.棉花GhCHI蛋白的酶活檢測
　　為確定GhCHI蛋白的催化活性，構(gòu)建了pET-28a-GhCHI-A/

5、D蛋白表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在大腸桿菌E.coli中誘導(dǎo)出了目的蛋白，純化得到了相應(yīng)的融合蛋白。實(shí)驗表明GhCHI-A和 GhCHI-D重組蛋白均能在體外催化查耳酮異構(gòu)為柚皮素，但均沒有檢測到催化柚皮素轉(zhuǎn)化為查耳酮的活性；其最適反應(yīng)pH均為8.0，最適反應(yīng)溫度均為37℃。在最適反應(yīng)條件下，這兩個蛋白的酶動力學(xué)參數(shù)稍有差別，其中GhCHI-A重組蛋白的Km=133.75nM，Vmax=0.0137nM/min；GhCHI-D重組蛋白

6、的Km=211.10nM，Vmax=0.0226nM/min。這些結(jié)果表明GhCHI-A和GhCHI-D蛋白均是具有催化活性的I型CHI蛋白。
　　3.GhCHI-A影響棉花類黃酮的積累
　　為探究GhCHI在類黃酮合成途徑中的功能，構(gòu)建了GhCHI-A RNAi干擾載體和GhCHI-A超量表達(dá)載體，通過棉花遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入陸地棉（J14），經(jīng)組織染色鑒定、自交，分別獲得了純合的轉(zhuǎn)基因植株。GhCHI基因在GhCHI-A RNA

7、i抑制植株中的表達(dá)水平顯著降低，在GhCHI-A超量表達(dá)植株中的表達(dá)量均相對野生型提高了10倍以上；同時，酶活檢測發(fā)現(xiàn)RNAi抑制棉花體內(nèi)CHI酶活顯著降低，而超量表達(dá)植株中CHI酶活略有升高。通過類黃酮含量檢測發(fā)現(xiàn)，RNAi抑制植株的葉片、花瓣（開花當(dāng)天和開花后1天）的花色素含量顯著增加，幼嫩根尖區(qū)域的槲皮素含量、種子中原花色素（PAs）含量提高；而超量表達(dá)植株與對照植株相比，葉片、花瓣（0dpa）的花色素含量顯著降低，根尖區(qū)域的槲皮

8、素含量以及PAs含量沒有明顯變化。表明下調(diào)GhCHI-A基因的表達(dá)可以促進(jìn)棉花的花色素、槲皮素等類黃酮的積累，而上調(diào)表達(dá)該基因卻抑制了葉片中花色素的積累。
　　4.調(diào)控GhCHI-A基因的表達(dá)影響棉花的生長發(fā)育
　　為探索GhCHI對棉花生長發(fā)育的影響，比較了不同轉(zhuǎn)基因材料和對照材料在植株生長、種子和纖維性狀方面的差異。通過觀察分析發(fā)現(xiàn)，RNAi抑制植株嚴(yán)重矮化，植株高度降低了15.5％，種子百粒重下降了20%，衣分提高了1