雞IFN-γ基因的克隆及原核表達.pdf

1、γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)是一類主要由活化的T淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生的細胞因子，其作用包括廣泛的抗微生物感染(病毒、細胞內(nèi)寄生菌和寄生蟲)、抗腫瘤和調(diào)節(jié)機體免疫功能。尤其在抗病毒感染和調(diào)節(jié)機體免疫功能方面作用顯著，是動物機體內(nèi)主要的免疫調(diào)節(jié)因子之一，因此可望研發(fā)成為新型天然生物佐劑。為此，本研究進行了雞IFN-γ基因的克隆和原核表達，為進一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容：1.雞IFN-γ基因的克隆。用刀豆素(Co

2、nA)刺激分離的脾淋巴細胞后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴增IFN-γ基因，然后將擴增產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體連接，獲得pGEM-T-easy/CHIFN-γ重組質(zhì)粒，對其進行酶切、PCR及基因測序鑒定，結(jié)果表明，本研究克隆得到了完整的雞IFN-γ基因，與GeneBank中登錄的雞IFN-γ基因序列完全一致，而且還發(fā)現(xiàn)ConA刺激誘導脾淋巴細胞6h、8h效果較好。2.雞IFN-γ基因的原核表達。在雞IFN-γ基因

3、開放閱讀框(ORF)兩側(cè)設(shè)計表達引物，以pGEM-T-easy/CHIFN-γ質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pGEX-4T-1分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，純化回收后連接獲得pGEX-4T-1/CHIFN-γ重組質(zhì)粒；進一步將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，酶切、PCR及基因測序鑒定正確的重組菌用ITPG誘導表達，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物。 結(jié)果表明，雞IFN-γ基因插入方向正確，并在大腸桿菌中被成功表達，