大鼠視覺可塑性相關(guān)基因cDNA消減文庫的構(gòu)建及篩選.pdf

1、目的：采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建大鼠視覺可塑性相關(guān)基因的cDNA消減文庫，篩選與視覺可塑性關(guān)鍵期終止相關(guān)的基因及與視覺可塑性相關(guān)的基因，探討視覺可塑性及其關(guān)鍵期終止的分子機(jī)制。 方法：本研究主要分為四個部分，各部分的具體研究方法如下：1、自行設(shè)計(jì)并制作專用大鼠暗飼養(yǎng)箱，建立暗飼養(yǎng)動物模型及暗飼養(yǎng)后予光照刺激動物模型。2、采用暗飼養(yǎng)動物模型(D67)及暗飼養(yǎng)后予光照刺激動物模型(D60+L7)，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建大鼠視皮質(zhì)

2、與視覺可塑性關(guān)鍵期終止相關(guān)基因的cDNA消減文庫。并通過PCR篩選、反向Northern雜交、測序及同源性檢索對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，篩選視覺可塑性關(guān)鍵期終止相關(guān)基因。3、應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建幼年(P28)和成年(P60)大鼠視皮質(zhì)差異表達(dá)基因的cDNA消減文庫。并通過PCR篩選、反向Northern雜交、測序及同源性檢索對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，篩選視覺可塑性相關(guān)基因。4、采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測部分篩選到的基因在不同組大鼠

3、視皮質(zhì)中表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)篩選到的差異表達(dá)基因的真實(shí)性。 結(jié)果：1、自行設(shè)計(jì)并成功制作了能滿足實(shí)驗(yàn)要求的專用大鼠暗飼養(yǎng)箱，成功建立了暗飼養(yǎng)動物模型及暗飼養(yǎng)后予光照刺激動物模型。2、成功構(gòu)建了大鼠視皮質(zhì)與視覺可塑性關(guān)鍵期終止相關(guān)基因的cDNA消減文庫，經(jīng)篩選，得到14個在D60+L7大鼠視皮質(zhì)中上調(diào)表達(dá)基因的片段。其中13個為已知基因，一個為新基因片斷。發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白9、烯醇酶-1、熱休克蛋白8、脂肪細(xì)胞補(bǔ)體

4、相關(guān)蛋白、肽基脯氨酸異構(gòu)酶A、非神經(jīng)元烯醇酶及ftp-3基因參與了視覺可塑性關(guān)鍵期的終止，同時，也篩選到既往有文獻(xiàn)報(bào)道其功能與可塑性相關(guān)的β-微管蛋白基因、髓磷脂堿蛋白基因、親環(huán)素基因參與了視覺可塑性關(guān)鍵期的終止。3、成功構(gòu)建了幼年和成年大鼠視皮質(zhì)差異表達(dá)基因的cDNA消減文庫，經(jīng)過篩選，最后確定了11個基因在視覺可塑性關(guān)鍵期內(nèi)的大鼠(P28)視皮質(zhì)中上調(diào)表達(dá)，4個基因在視覺可塑性關(guān)鍵期終止后的大鼠(P60)視皮質(zhì)中上調(diào)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)硬脂酰

5、基.輔酶A去飽和酶2基因、α血紅蛋白基因、谷氨酸-脯氨酸二肽重復(fù)蛋白基因、mDi4、不均一核糖核酸核蛋白C1/C2基因、strainBN/SsNHsdMCWmitochondrion參與了視覺可塑性過程，為視覺可塑性相關(guān)基因；而熱休克蛋白8基因、strainF344xBNF1mitochondrion、BHE/CdbtRNA-Lysgene、線粒體基因參與了成年大鼠視覺可塑性關(guān)鍵期的終止。同時，也篩選到既往有文獻(xiàn)報(bào)道的其功能與視覺可塑性

6、相關(guān)的基因，如：蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)基因，調(diào)鈣蛋白2基因，細(xì)胞色素b基因等在幼年大鼠視覺可塑性高峰期視皮質(zhì)中高表達(dá)。4、應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了Hsp8mRNA在P60組視皮質(zhì)中表達(dá)顯著高于P28組，PlpmRNA在P28組視皮質(zhì)中表達(dá)顯著高于P60組，MbpmRNA在D60+L7組視皮質(zhì)中表達(dá)顯著高于D67組，證實(shí)Hsp8、Mbp基因?yàn)橐曈X可塑性關(guān)鍵期終止基因，而Plp基因?yàn)橐曈X可塑性基因，同時也進(jìn)一步驗(yàn)證了所構(gòu)建的cDNA消減文庫

7、的可靠性。 結(jié)論：通過大鼠視皮質(zhì)視覺可塑性關(guān)鍵期終止相關(guān)基因的cDNA消減文庫及大鼠視皮質(zhì)視覺可塑性相關(guān)基因的cDNA消減文庫的建立，為進(jìn)一步闡明視覺可塑性關(guān)鍵期及其終止的分子機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)。初步篩選出一批視覺可塑性關(guān)鍵期終止相關(guān)基因及視覺可塑性相關(guān)基因，對這些基因的進(jìn)一步篩選及驗(yàn)證，將有助于發(fā)現(xiàn)決定視覺可塑性關(guān)鍵期終止及視覺可塑性的關(guān)鍵基因，為下一步采用基因治療手段對視覺可塑性關(guān)鍵期進(jìn)行調(diào)控提供可能，從而打破弱視治療的時