CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在妊娠及分娩發(fā)動(dòng)中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、第一章 CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在不同妊娠時(shí)期中的變化
　　 目的：
　　 通過研究不同妊娠時(shí)期母體外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)含量及Foxp3 mRNA表達(dá)水平變化規(guī)律，探討CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在妊娠維持中的作用。
　　 方法：
　　 選擇2009年8月-2010年6月在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院產(chǎn)科門

2、診定期產(chǎn)檢的孕婦共60例(早孕組20例，中孕組20例，晚孕組20例)和同期于我院門診體檢的正常未孕婦女20例。收集每位受試對象抗凝外周血10ml，分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例，半定量RT-PCR檢測單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1早、中、晚孕孕婦外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例分別為

3、6.39(6.04-8.33)％、7.90(6.18-9.30)％和7.46(6.59-7.94)％，正常未孕對照組為3.08(2.66-3.30)％。早孕婦女外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞較未孕婦女顯著升高(P<0.01)。隨著妊娠進(jìn)展，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞含量上升，至中孕期達(dá)高峰，晚孕期較中孕期稍低，但三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 2早、中、晚孕組孕婦外周血中Foxp3

4、mRNA相對表達(dá)水平均顯著高于正常未孕組，分別為[(0.564±0.138)、(0.649±0.126)、(0.602±0.088)vs(0.307±0.052)](P均<0.01)，但早、中、晚孕組三組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。我們發(fā)現(xiàn)外周血Foxp3mRNA表達(dá)水平變化與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞含量變化規(guī)律一致，即妊娠后外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞含量較未

5、孕者顯著增高(P<0.01)，至中孕期達(dá)高峰，晚孕期較中孕期稍低(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.妊娠期外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平變化與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞含量變化規(guī)律一致，提示Foxp3是檢測Treg細(xì)胞的指標(biāo)。
　　 2.妊娠后母體外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞含量較未孕者顯著升高提示Treg細(xì)胞在正常妊娠維持中起重要作用。
　　 第二章 CD

6、4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在早產(chǎn)、足月妊娠分娩發(fā)動(dòng)后的變化
　　 目的：通過研究早產(chǎn)及足月妊娠分娩發(fā)動(dòng)后母體外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞含量及Foxp3 mRNA表達(dá)水平變化規(guī)律、蛻膜組織Foxp3 mRNA及蛋白表達(dá)水平變化規(guī)律，探討CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在早產(chǎn)及足月妊娠分娩發(fā)動(dòng)中的作用。
　　 方法：
　　 選擇2009年8月-2010年6月在中南大學(xué)湘雅

7、三醫(yī)院產(chǎn)科住院病例及同期在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院產(chǎn)科門診定期產(chǎn)檢的正常孕婦，共99例：分足月組共48例(其中足月未臨產(chǎn)組20例，足月臨產(chǎn)組28例)；孕滿28周至不足37周組共51例(其中先兆早產(chǎn)組16例；早產(chǎn)臨產(chǎn)15例；正常孕婦20例)。收集每位受試對象抗凝外周血10ml；足月和早產(chǎn)產(chǎn)婦胎盤娩出后立即剪取胎盤邊緣胎膜組織約10g，將壁蛻膜從平滑絨毛膜上剝離采集；早產(chǎn)產(chǎn)婦取胎盤中心一塊1cm×lcm大小胎盤全層組織(包括羊膜層到底蛻膜層)。分

8、離外周血單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例，半定量RT-PCR法檢測單個(gè)核細(xì)胞及蛻膜組織中Foxp3 mRNA表達(dá)水平，Western Blot檢測蛻膜組織Foxp蛋白表達(dá)水平，并通過早產(chǎn)產(chǎn)婦胎盤HE染色，觀察早產(chǎn)患者中組織學(xué)絨毛膜羊膜炎分布情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.足月未臨產(chǎn)組與臨產(chǎn)組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比分別為7

9、.46(6.59-7.94)％、3.52(2.98-4.16)％，可見足月臨產(chǎn)后母體外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞較臨產(chǎn)前下降，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 2.足月臨產(chǎn)后母體外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平較臨產(chǎn)前明顯下降，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(0.312±0.050)vs(0.602±0.088)，(P<0.01)]。
　　 3.足月臨產(chǎn)前、后蛻膜組織Foxp3 mRNA及

10、蛋白表達(dá)水平相比均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(0.556±0.090)vs(0.249±0.085)、(0.579±0.093)vs(0.280±0.078)](P均<0.01)。
　　 4.先兆早產(chǎn)16例中有6例早產(chǎn)，早產(chǎn)臨產(chǎn)組15例均發(fā)生早產(chǎn)，即早產(chǎn)患者共21例，其中16例(76％)胎盤病檢有組織學(xué)絨毛膜羊膜炎。
　　 5.先兆早產(chǎn)組、早產(chǎn)臨產(chǎn)組與正常妊娠對照組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞

11、百分比分別為5.27(3.82-7.44)％、1.63(1.09-2.73)％和7.38(6.90-8.78)％，可見早產(chǎn)臨產(chǎn)組較先兆早產(chǎn)組母體外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞顯著下降(P<0.01)，而先兆早產(chǎn)組Treg細(xì)胞含量較正常妊娠對照組也下降，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。早產(chǎn)有組織學(xué)絨毛膜炎組較無組織學(xué)絨毛膜炎組外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞顯著下降[1.68(1.15-2.68)％

12、vs3.34(2.71-5.05)％](P<0.01)。早產(chǎn)患者不管有無組織學(xué)絨毛膜炎該類細(xì)胞含量均較正常妊娠對照組顯著降低(P<0.01)，而早產(chǎn)無組織學(xué)絨毛膜炎組與足月臨產(chǎn)組比較則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 6.正常妊娠對照組、先兆早產(chǎn)組與早產(chǎn)臨產(chǎn)組外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平分別為(0.632±0.092)、(0.477±0.156)和(0.168±0.085)，可見早產(chǎn)臨產(chǎn)組較先兆早產(chǎn)組外周血

13、單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達(dá)水平降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，而先兆早產(chǎn)組較正常妊娠對照組比較Foxp3 mRNA表達(dá)水平也明顯下降(P<0.01)。
　　 7.早產(chǎn)有組織學(xué)絨毛膜炎組蛻膜組織Foxp3 mRNA及蛋白表達(dá)水平較無組織學(xué)絨毛膜炎組明顯下降[(0.146±0.020)vs(0.228±0.016)、(0.141±0.030)vs(0.246±0.030)](P均<0.01)。早產(chǎn)無組織學(xué)絨毛膜炎組

14、蛻膜組織Foxp3 mRNA及蛋白表達(dá)水平與足月臨產(chǎn)組比較則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 足月及早產(chǎn)孕婦體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量均減少，提示免疫負(fù)調(diào)節(jié)功能減弱，可能與分娩發(fā)動(dòng)相關(guān)。
　　 第三章 PD-1中和抗體對孕鼠孕齡及分娩間隔的影響及其機(jī)制探討
　　 目的：
　　 建立妊娠小鼠模型，運(yùn)用PD-1中和抗體阻斷技術(shù)，研究PD-1介導(dǎo)的CD4+CD2

15、5+Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能對孕鼠孕齡及分娩發(fā)動(dòng)進(jìn)程的影響，以探討Treg細(xì)胞在分娩發(fā)動(dòng)中的可能作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.建立孕齡準(zhǔn)確的孕鼠模型，將其隨機(jī)分為PD-1中和抗體組、IgG組和生理鹽水組三組，每組各6只，于孕5，8，11，14天按組別不同分別腹腔注射PD-1中和抗體250μg、IgG250μg或等量生理鹽水。
　　 2.隨機(jī)選6只未合籠雌鼠及6只尚未藥物干預(yù)的孕鼠，頸椎脫臼法處死后取脾臟，分

16、離脾臟單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測妊娠前后CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例及PD-1在CD4+CD25+Treg細(xì)胞中表達(dá)情況變化。
　　 3.觀察PD-1中和抗體干預(yù)后對孕鼠孕齡及分娩間隔的影響。
　　 4.應(yīng)用半定量RT-PCR和Western blot檢測PD-1中和抗體干預(yù)后對孕鼠胎盤組織Th1細(xì)胞因子(TNF-α，IFN-γ)、Th2細(xì)胞因子(IL-4，IL-10)mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

17、。
　　 結(jié)果：
　　 1.小鼠妊娠前、后脾臟單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比分別為(5.88±0.84)％、(13.89±1.69)％，可見小鼠妊娠后脾臟單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+Treg細(xì)胞含量顯著上升(P<0.01)。小鼠妊娠前、后PD-1占CD4+CD25+Treg細(xì)胞陽性比例分別為(6.41±0.90)％、(7.40±0.86)％，小鼠妊娠后PD-1占CD4+CD25+Tr

18、eg細(xì)胞比例上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 2.PD-1中和抗體對孕鼠孕齡的影響：在PD-1中和抗體組，IgG組，生理鹽水組三組小鼠孕齡分別為(19.74±0.40)，(20.14±0.45)和(20.00±0.26)天，可見三組孕鼠孕齡均>19天，無早產(chǎn)發(fā)生。PD-1中和抗體組孕齡稍短于其他兩組，但三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3.PD-1中和抗體對孕鼠分娩間隔的影響：在PD-1中和抗體組，

19、IgG組，生理鹽水組三組孕鼠分娩間隔依次為(5.78±1.68)，(7.86±1.58)和(8.03±1.64)分鐘，可見PD-1中和抗體組孕鼠分娩間隔比IgG組和生理鹽水組縮短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)，IgG組與生理鹽水組比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 4.PD-1中和抗體影響分娩間隔的可能機(jī)制：
　　 1)孕鼠胎盤組織IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ mRNA在PD-1中和抗體組，IgG組

20、，生理鹽水組相對表達(dá)水平分別為(0.13±0.03，0.17±0.04，0.18±0.04)、(0.14±0.05，0.20±0.02，0.21±0.04)、(0.39±0.06，0.29±0.06，0.31±0.07)、(0.36±0.07，0.27±0.04，0.26±0.04)，可見PD-1中和抗體組胎盤組織IL-4mRNA、IL-10 mRNA表達(dá)水平與其余兩組比較明顯下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)；而PD-1中和抗體組胎

21、盤組織TNF-αmRNA、IFN-γmRNA表達(dá)水平則較另外兩組上調(diào)(P均<0.05)。
　　 2)孕鼠胎盤組織IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ蛋白在PD-1中和抗體組，IgG組，生理鹽水組相對表達(dá)水平分別為(0.13±0.02，0.22±0.04，0.19±0.04)、(0.16±0.04，0.22±0.03，0.21±0.05)、(0.41±0.06，0.33±0.05，0.31±0.07)、(0.36±0.06

22、，0.29±0.04，0.28±0.04)，可見PD-1中和抗體組胎盤組織IL-4蛋白、IL-10蛋白相對表達(dá)水平與其余兩組比較明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)；而PD-1中和抗體組胎盤組織TNF-α蛋白、IFN-γ蛋白相對表達(dá)水平比另外兩組上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面可以表達(dá)PD-1。
　　 2.PD-1中和抗體干預(yù)后引起孕鼠體內(nèi)Th