百草枯處理HUVEC后NF-κB表達(dá)及其反義寡核苷酸干預(yù)作用研究.pdf

1、目的：NF- кB的活化可誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的合成，促發(fā)炎癥反應(yīng)，百草枯中毒后早期即有炎癥反應(yīng)參與組織損傷。故利用體外培養(yǎng)人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)建立百草枯處理細(xì)胞模型，探測(cè)NF-кB在百草枯處理后細(xì)胞內(nèi)的激活，以及檢測(cè)采取反義寡核苷酸減少其活性單位p65表達(dá)后的治療效果。 方法：通過(guò)體外培養(yǎng)HUVEC建立百草枯處理模型，采用MTT比色試驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞存活率來(lái)確定百草枯48h半數(shù)抑制濃度。在百草枯作用8h、24h、48h后利用免疫

2、細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞NF-кB p65蛋白活化及定位。合成針對(duì)p65的硫代修飾反義寡核苷酸和正義寡核苷酸，脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸和正義寡核苷酸，RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)NF-кB p65的mRNA水平和蛋白水平的變化。將百草枯作用24h后的細(xì)胞分為三組，第一組脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NF-кB p65反義寡核苷酸；第二組脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NF-кB p65正義寡核苷酸；第三組不接受任何處理，通過(guò)MTT法檢測(cè)干預(yù)后24h、48h、72

3、h各組細(xì)胞活力，計(jì)算其存活率，統(tǒng)計(jì)分析各組間差異。 結(jié)果：MTT檢測(cè)了11個(gè)濃度梯度百草枯對(duì)細(xì)胞的抑制作用，計(jì)算半數(shù)抑制濃度為1.22mM；免疫組化顯示正常細(xì)胞NF-кB p65定位于胞漿，百草枯作用8h后，胞漿著色加深，細(xì)胞核出現(xiàn)了陽(yáng)性著色，24h后細(xì)胞核著色數(shù)目增多，48h后殘活細(xì)胞仍為核染色；轉(zhuǎn)染NF-кB p65反義寡核苷酸能下調(diào)NF-кB p65的mRNA和蛋白水平；通過(guò)MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h后細(xì)胞存活

4、率得出：反義寡核苷酸組為96.1％、86.2％、67.6％，正義寡核苷酸組為87.4％、72.6％、33.8％，未轉(zhuǎn)染組為90.8％、73.5％、33.2％，在轉(zhuǎn)染后48h、72h時(shí)段各組之間相比其差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：百草枯處理后早期即可能出現(xiàn)了NF-кB的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)了炎性介質(zhì)的合成，促發(fā)和推進(jìn)炎癥反應(yīng)。利用針對(duì)NF-кB的活性蛋白p65的反義寡核苷酸進(jìn)行干預(yù)，可抑制NF-кB的活性蛋白p65的表達(dá)，減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕炎