利用RNAi與CRISPR-Cas9靶向Y染色體基因?qū)π∈笤缙谂咛グl(fā)育的影響.pdf

1、性別控制技術(shù)在畜牧業(yè)中有重要的應(yīng)用價(jià)值。哺乳動(dòng)物Y染色體編碼的基因大部分與性別發(fā)育有關(guān)。通過調(diào)控Y染色體基因的表達(dá)或功能將可能改變性別比例。
　　本研究選取了Y染色體上的Dby基因作為靶基因，該基因的mRNA在成熟精子中和早期胚胎發(fā)育過程中均能夠被檢測(cè)到，暗示著該基因的功能可能與雄性胚胎的發(fā)育相關(guān)。我們利用RNA干擾的方法，研究下調(diào)小鼠早期胚胎中Dby基因的表達(dá)量對(duì)雄性胚胎發(fā)育及出生后雄性小鼠生殖能力的影響。針對(duì)Dby基因mRNA

2、的編碼區(qū)查找到4個(gè)靶位點(diǎn)，分別構(gòu)建了表達(dá)shRNA的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞系篩選出具有最佳抑制效果的shRNA1，其能夠使細(xì)胞中Dby基因表達(dá)量顯著下調(diào)至對(duì)照組的14％。根據(jù)shRNA1序列設(shè)計(jì)合成siRNA，對(duì)小鼠受精卵進(jìn)行雄原核顯微注射，發(fā)現(xiàn)siRNA使體外培養(yǎng)至8細(xì)胞期的胚胎Dby基因表達(dá)量極顯著下調(diào)至對(duì)照組的6.1%；注射抗Dby的siRNA對(duì)移植到受體母鼠體內(nèi)的胚胎發(fā)育效率、性別比例沒有顯著影響，但是對(duì)雄性小鼠配

3、種后的受胎率有顯著影響，對(duì)雄性小鼠的睪丸發(fā)育也有一定的抑制作用。這表明在小鼠早期胚胎中利用RNA干擾技術(shù)能夠有效地抑制Dby基因表達(dá)，但Dby基因表達(dá)量下調(diào)對(duì)雄性胚胎的發(fā)育沒有影響，對(duì)出生后雄性小鼠的生殖能力會(huì)造成一定影響。
　　同時(shí)，本研究選取了Y染色體上的多拷貝基因Rbmy為靶基因，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性地切割Rbmy基因，研究其破壞Y染色體的可能性。針對(duì)Rbmy基因查找了6個(gè)靶位點(diǎn)，分別構(gòu)建了相應(yīng)的真核表達(dá)載體

4、、原核表達(dá)載體及驗(yàn)證用靶載體。將Cas9、sgRNA及熒光報(bào)告靶載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，通過檢測(cè)細(xì)胞的熒光效率及熒光強(qiáng)度，比較CRISPR/Cas9系統(tǒng)在不同靶位點(diǎn)處的切割效率。本研究發(fā)現(xiàn)sgRNA6在293T細(xì)胞系上的切割效果最佳，其熒光效率達(dá)到52.64%，顯著高于對(duì)照組，接近陽(yáng)性對(duì)照的水平，且熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。接著進(jìn)行了sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄，利用sgRNA在體外能夠與Cas9蛋白結(jié)合形成核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)，在體外檢測(cè)了CRISPR/C