不同溫度熱療對小鼠惡性黑色素瘤增殖和侵襲能力的影響.pdf

1、研究背景：惡性黑色素瘤是由黑色素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成的一種高度惡性腫瘤，發(fā)病率為全身惡性腫瘤的1％～2％，占皮膚惡性腫瘤的20％。其侵襲性強，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨和肝臟，進(jìn)展期黑色素瘤患者平均生存期僅6～9個月，對人民群眾的生命帶來極大危害。治療惡性黑色素瘤的關(guān)鍵在于控制其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，由于其對常規(guī)治療手段如化療、放療等敏感性較低，目前對于進(jìn)展期惡性黑色素瘤還無有效的預(yù)防治療方法。
　　 腫瘤熱療(Hyperthe

2、rmia)是一種以非電離輻射方式作用于腫瘤的物理治療方法，與化療和放療相比其優(yōu)勢在于較少受限于其毒副作用，并能夠多次重復(fù)使用，且可以增強放射治療和化學(xué)藥物治療的效果，被國際醫(yī)療界稱為“綠色療法”。傳統(tǒng)的腫瘤熱療方法常常不能將腫瘤加熱到治療溫度，新近研發(fā)的磁感應(yīng)加溫治療可以將腫瘤組織加熱到50℃左右，而使正常組織保持不升溫，有效殺滅靶區(qū)內(nèi)的腫瘤組織。近年來的動物實驗證明了熱療不僅可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，還可抑制其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。也有研究報道了熱療

3、對轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。但對熱療抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的具體機制尚不十分清楚，有待進(jìn)一步探索。
　　 基于以上觀點，本研究將采用不同溫度體內(nèi)外加熱小鼠黑色素瘤，系統(tǒng)的研究41℃～50℃范圍內(nèi)不同溫度熱療對B16F10細(xì)胞的增殖、侵襲、運動能力的影響，并研究其相關(guān)分子機制，將有助于臨床個體化的熱療方案，為熱療治療惡性黑色素瘤的臨床應(yīng)用提供部分理論和實驗依據(jù)。
　　 第一章、不同溫度熱療對黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖和周期的

4、影響
　　 目的：探討不同溫度熱療對黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖以及周期分布的影響。
　　 方法：采用水浴對黑色素瘤B16F10細(xì)胞行41℃、43℃、45℃、47℃、50℃實驗組和對照組(37℃)熱療，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)儀測定細(xì)胞周期分布的變化。
　　 結(jié)果：45℃，47℃，50℃組的細(xì)胞增殖抑制率在24h、48h、72h、96h明顯高于41℃和43℃組(P＜0.05)。47℃

5、，50℃組的細(xì)胞增殖抑制率在24h、48h、72h、96h均明顯高于45℃組(P＜0.05)。在47℃、50℃兩組之間，各時間段的差異無顯著性(P＞0.05)。與37℃對照組相比，41℃、43℃組的G0/G1期細(xì)胞明顯增多，而S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)。47℃和50℃組的G0/G1期細(xì)胞比37℃組明顯減少(P＜0.05)，而S期細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)，在47℃和50℃組之間無明顯差異。與37℃對照組相比，43℃組的G2/M期

6、細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：45℃及以上溫度熱療可明顯抑制B16F10細(xì)胞的體外增殖能力；45℃熱療對B16F10細(xì)胞S期比例無明顯影響，47℃及以上溫度熱療使其發(fā)生S期阻滯。結(jié)果提示：45℃及以上溫度熱療不僅可以有效抑制B16F10細(xì)胞的增殖活性，且可以減少熱耐受的產(chǎn)生，而高于47℃的熱療并不產(chǎn)生更強的抑制作用。
　　 第二章、不同溫度熱療對B16F10細(xì)胞運動及體外侵襲能力的影響
　　 目的：

7、研究不同溫度熱療對黑色素瘤B16F10細(xì)胞形態(tài)、運動能力及體外侵襲能力的影響。
　　 方法：采用水浴對黑色素瘤B16F10細(xì)胞行41℃、43℃、45℃、47℃、50℃實驗組和37℃對照組熱療，倒置顯微鏡下觀察熱療后不同時間點細(xì)胞形態(tài)的變化；透射電鏡觀察熱療后24h細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的改變。取43℃、45℃、47℃實驗組和37℃對照組熱療后的細(xì)胞進(jìn)行劃痕實驗檢測細(xì)胞的運動能力；侵襲小室實驗檢測細(xì)胞體外侵襲能力；明膠酶譜法檢測不同溫度熱療

8、后24h內(nèi)B16F10細(xì)胞的MMP-2及MMP-9的分泌量及活性。
　　 結(jié)果：(1)B16F10細(xì)胞在41℃、43℃加熱后更趨于成熟，分化更好，惡性程度降低，而45℃及以上溫度熱療后細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，細(xì)胞活力下降。(2)與37℃（對照組）相比，43℃、45℃、47℃組細(xì)胞運動能力均減弱，45℃、47℃組細(xì)胞運動能力下降尤其明顯。(3)37℃（對照組）、43℃，45℃及47℃熱療后，平均每個視野中B16F10細(xì)胞穿過Matrig

9、el膠到達(dá)Transwell小室膜背面的細(xì)胞數(shù)隨熱療溫度升高而降低，各組間均存在明顯差異(P＜0.05)。(4)與37℃組相比，43℃、45℃、47℃熱療后24h內(nèi)B16F10細(xì)胞MMP-2及MMP-9的分泌量及活性明顯下降(P＜0.05)，并且與43℃組相比，45℃、47℃熱療組MMP-2的分泌量及活性進(jìn)一步下降(P＜0.05)，而45℃、47℃熱療組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：不同溫度熱療后細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)

10、構(gòu)發(fā)生不同程度的改變，45℃及以上溫度熱療的主要表現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞；43℃、45℃及47℃熱療均可抑制B16F10細(xì)胞的運動能力，且對黑素瘤細(xì)胞明膠酶活性均有抑制作用，45℃、47℃熱療組MMP-2的分泌量及活性較43℃下降更明顯；43℃、45℃及47℃對腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力的抑制作用隨熱療溫度升高而增強。說明B16F10細(xì)胞侵襲能力的減弱主要與細(xì)胞運動能力及明膠酶活性受到抑制有關(guān)。
　　 第三章、熱療對B16F10細(xì)胞內(nèi)侵

11、襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的影響
　　 目的：研究小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞經(jīng)過不同溫度熱療后TGF-β1等侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化。
　　 方法：采用水浴對黑色素瘤B16F10細(xì)胞行43℃、45℃、47℃實驗組和37℃對照組熱療，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測不同溫度熱療后24hTGF-β1、VEGF蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化，rt-PCR檢測不同溫度熱療后繼續(xù)培養(yǎng)2h、6h、12h、24h TGF-β1、Smad4、VEGF、MM

12、P-2及MMP-9在mRNA水平的表達(dá)變化。Western Blotting檢測不同溫度熱療后繼續(xù)培養(yǎng)2h、6h、12h、24hTGF-β1、Smad4在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：(1)不同溫度熱療后24h細(xì)胞內(nèi)TGF-β1蛋白表達(dá)降低，43℃、45℃、47℃組的平均光密度值(AOD)與37℃對照組相比，明顯降低(P＜0.05)；同樣，VEGF蛋白表達(dá)也下降，43℃、45℃、47℃組的平均光密度值(AOD)與37℃對照組

13、相比，也明顯降低(P＜0.05)，二者均呈現(xiàn)一定程度的溫度依賴性。(2)與37℃對照組相比，43℃熱療后各時間點MMP-9、VEGF mRNA的表達(dá)均降低(P＜0.05)，43℃熱療后6h～24hMMP-2、TGF-β1mRNA的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；45℃及47℃熱療后各時間點TGF-β1、VEGF、MMP-2及MMP-9mRNA的表達(dá)均降低；各時間點Smad4 mRNA的表達(dá)均無明顯變化。(3)與37℃對照組相比，43℃熱療

14、后12h～24h出現(xiàn)TGF-β1蛋白表達(dá)降低及Smad4蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；45℃熱療后6h～24hTGF-β1蛋白表達(dá)明顯下降，6h～12h Smad4蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；47℃熱療后各個時間點TGF-β1蛋白的表達(dá)均降低(P＜0.05)，而Smad4蛋白表達(dá)的增加(P＜0.05)只出現(xiàn)在熱療后2h～6h(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞中TGF-β1、Smad4在mRNA和蛋白水

15、平的表達(dá)變化與熱療溫度和熱療后繼續(xù)培養(yǎng)的時間有關(guān)。43℃及以上溫度熱療使(MMP)-2/9和VEGF的基因表達(dá)明顯抑制，同時有TGF-β1基因表達(dá)的下調(diào)，此三者之間可能存在相互影響。而TGF-β1蛋白水平的上調(diào)相對滯后于其基因水平的變化，Smad蛋白表達(dá)一過性增加?？傊?，實驗結(jié)果說明了TGF-β1表達(dá)的下調(diào)可能為熱療抑制B16F10細(xì)胞增殖及體外侵襲能力的機制之一。
　　 第四章、不同溫度磁熱療對小鼠黑色素瘤皮下移植瘤的影響

16、r>　　 目的：探討不同溫度磁熱療對小鼠惡性黑色素瘤皮下移植瘤的作用。
　　 方法：用小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞株建C57BL6小鼠皮下移植瘤模型，將Fe3O4磁性納米顆粒直接注入腫瘤組織內(nèi)，在交變磁場中進(jìn)行磁感應(yīng)加熱治療，控溫在45℃和50℃分別持續(xù)30min和10min，24h后重復(fù)加熱，共加熱3次，比較45℃組磁熱療組(H1)、50℃磁熱療組(H2)、單純磁流體組（M組）、單純磁場組（T組）和對照組的腫瘤體積的大小、生

17、存期和TGF-β1的陽性指數(shù)。
　　 結(jié)果：與對照組相比，45℃磁熱療組和50℃磁熱療組均能抑制腫瘤的生長(P＜0.05)。與45℃磁熱療組比較，50℃磁熱療組抑瘤作用更顯著，有57.1％的腫瘤完全消退率(P＜0.05)。45℃MFH組和50℃MFH組的生存期分別為(40.286±8.592)d和(60.143±13.319)d比對照組的(17.429±3.054)d明顯延長(P＜0.05)。TGF-β1的陽性指數(shù)在50℃磁熱療