葉下珠復(fù)方抗HBV、人肝癌裸鼠移植瘤及其分子生物學(xué)機(jī)制探討.pdf

1、一、研究目的體外觀察葉下珠復(fù)方抗HBV及抑制HBsAg、HBeAg分泌的作用，在動(dòng)物體內(nèi)觀察葉下珠復(fù)方對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用，并初步揭示其護(hù)肝機(jī)制；研究葉下珠復(fù)方的體內(nèi)和體外抗腫瘤活性，并探討其抗腫瘤的分子生物學(xué)機(jī)制。 二、實(shí)驗(yàn)步驟1.觀察葉下珠復(fù)方體外抗HBV的作用2.葉下珠復(fù)方抗ConA所致的免疫性肝損傷3.葉下珠復(fù)方對(duì)人肝癌HePG2細(xì)胞體外增殖的抑制作用4.建立人肝癌HePG2裸鼠移植瘤模型5.葉下珠復(fù)方的體內(nèi)抗腫瘤作

2、用6.用RT-PCR、分子克隆、基因序列測(cè)定和免疫組化等方法觀察葉下珠復(fù)方對(duì)移植瘤裸鼠p53、c-myc基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 三、實(shí)驗(yàn)方法1.以2.2.15細(xì)胞為模型，根據(jù)MTT法檢測(cè)葉下珠復(fù)方的細(xì)胞毒性。用公式求算出藥物的最大無毒濃度及半效致死量TC50。將2.2.15細(xì)胞按1×105/ml接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1.2ml，次日棄培養(yǎng)液。以不同藥物對(duì)2.2.15細(xì)胞的最大無毒劑量為起始濃度，加入培養(yǎng)液稀釋(系列2倍稀釋)的

3、不同濃度的不同藥物，每濃度6孔，每3天換含藥物的培養(yǎng)液一次，同時(shí)設(shè)不加藥物對(duì)照。收集每次換液的培養(yǎng)上清250ul，-20℃凍存，集中用ELISA法測(cè)定HBsAg、HBeAg，并計(jì)算藥物對(duì)抗原的抑制率、半數(shù)有效濃度(IC50)和治療指數(shù)(TI)，判斷藥物效果，用熒光定量PCR測(cè)定HVB-DNA。 2.NIH小鼠48只隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，葉下珠復(fù)方大、中、小劑量組(40g/kg、20g/kg、10g

4、/kg)，聯(lián)苯雙酯(150mg/kg)治療組，除空白對(duì)照組外，其余小鼠于實(shí)驗(yàn)首日上午尾靜脈注射ConA20mg/kg，4h后各組開始灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組均灌等量生理鹽水，次日晨開始第二次給藥，第三天給藥后4h第二次尾靜脈注射ConA20mg/kg，8h后取摘眼球取血，賴氏法檢測(cè)ALT、AST，ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-8含量。肝臟取出后取左葉中性甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡觀察病理切片并拍照。

5、3.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HePG2細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，以2.5×104/孔種植于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的葉下珠復(fù)方50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml分別培養(yǎng)24h、48h和72h，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，每濃度組每時(shí)間段設(shè)6個(gè)平行孔。根據(jù)MTT法檢測(cè)葉下珠復(fù)方的半數(shù)有效濃度和各濃度的細(xì)胞增殖抑制率，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和各藥物處理組不同時(shí)間段的凋亡率，透射電鏡觀察葉下珠復(fù)方對(duì)HePG2細(xì)胞超

6、微結(jié)構(gòu)的影響。制作細(xì)胞爬片，葉下珠復(fù)方處理后用Hoect33258熒光染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡率。 4.將人肝癌HePG2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用含0.02％EDTA的0.125％胰酶消化，PBS洗滌細(xì)胞兩次，1000rpm離心3min，生理鹽水調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×108/ml，每只裸鼠項(xiàng)肩部皮下注射0.2ml。接種細(xì)胞第二天后，將裸鼠隨機(jī)分為3組，分別是葉下珠復(fù)方治療組，生理鹽水組(陰性對(duì)照)，5-Fu組(陽性對(duì)照組)。

7、治療組每天用葉下珠復(fù)方灌胃10g/kg，陰性對(duì)照組每天口服同體積生理鹽水，5-Fu組(陽性對(duì)照組)，腹腔注射5-Fu20mg/kg.d，每周給藥二次。觀察裸鼠成瘤情況和精神、飲食、活動(dòng)、大小便等一般情況，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體最大長(zhǎng)度(a)、寬度(b)和高度(c)，根據(jù)公式V=ab2/2，計(jì)算腫瘤體積，并畫出腫瘤體積時(shí)間生長(zhǎng)曲線。給藥35天后經(jīng)裸鼠眼眶靜脈叢取血后處死裸鼠(分離血清-20℃凍存?zhèn)溆?，剝離瘤組織，并稱瘤重，迅速置于液氮罐

8、中凍存。放免法檢測(cè)各組裸鼠血清中外周血甲胎球蛋白(AFP)含量，瘤體經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟切片，HE常規(guī)染色，光鏡下觀察、拍照，觀察其病理組織學(xué)改變。 5.將各組裸鼠瘤組織的RNA提取后逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR擴(kuò)增p53和C-myc基因。應(yīng)用NIHimage1.60軟件分析不同實(shí)驗(yàn)組p53和C-mycPCR產(chǎn)物的電泳條帶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。將表達(dá)的p53基因與pTARGETTM載體的連接，轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)菌中，

9、篩選陽性克隆提取細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，菌液送英駿廣州測(cè)序公司測(cè)序。裸鼠瘤組織以石蠟包埋制成4um厚的切片，以SP法檢測(cè)p53蛋白和C-myc蛋白表達(dá)。 四、結(jié)果1.在半數(shù)毒性濃度下，葉下珠復(fù)方濃度為250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml、31.25ug/ml、15.6ug/ml時(shí)對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制率分別為54.8％、43.6％、37.4％、26.7％、14.6％，其TI值為6.1；對(duì)HBeAg

10、的抑制率分別為78.6％、72.9％、67.1％、56.8％、51.5％，其TI值為24.6。不同濃度的葉下珠復(fù)方對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌的HBV-DNA抑制率不同，隨著藥物濃度的增加，HBV-DNA定量逐漸降低。但在1000ug/ml時(shí)由于藥物的毒性作用所致細(xì)胞死亡，大量病毒由細(xì)胞釋出，HBV-DNA絕對(duì)量反而增加。 2.在血清生化檢查的結(jié)果中，模型組ALT、AST及TNF-α、IL-8水平明顯高于空白對(duì)照組，其差異有顯著性意義

11、(p＜0.01)，說明造模成功。葉下珠復(fù)方各劑量組ALT、AST及TNF-α、IL-8活性均低于模型組，其差異有顯著性意義(p＜0.01)，說明葉下珠復(fù)方各劑量組均對(duì)ALT、AST及TNF-α、IL-8有顯著降低作用。葉下珠復(fù)方各劑量組ALT、AST與聯(lián)苯雙酯組比較無顯著意義(p＞0.05)，但葉下珠復(fù)方各劑量組TNF-α水平與聯(lián)苯雙酯組比較有顯著性意義(p＜0.05)，說明葉下珠復(fù)方各劑量組對(duì)TNF-α的降低效果優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組，聯(lián)苯雙

12、酯組對(duì)TNF-α無降低作用。在葉下珠復(fù)方各劑量組之間比較，大、中劑量組與小劑量組之間有顯著性差異(p＜0.05)，大劑量和中劑量組優(yōu)于小劑量組。肝組織病理切片顯示，空白組小鼠肝小葉排列整齊，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇未見異常。模型組肝細(xì)胞濁脹、輕度脂肪變性，有的呈氣球樣變，可見明顯點(diǎn)狀壞死及大片灶狀壞死，壞死灶周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，Kupffer細(xì)胞增加。聯(lián)苯雙酯組病變較輕，但該組仍有少量標(biāo)本小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，各標(biāo)本均

13、有小灶性壞死和肝細(xì)胞濁腫，Kupffer細(xì)胞輕度增加，少數(shù)血管出現(xiàn)輕度浸潤(rùn)；葉下珠復(fù)方小劑量組與聯(lián)苯雙酯組相當(dāng)，小部分標(biāo)本仍可見大面積灶性壞死，各標(biāo)本均有小灶性壞死、肝細(xì)胞濁腫、輕度脂肪變性，大部分血管出現(xiàn)極輕度圍管浸潤(rùn)，Kupffer細(xì)胞輕度增加；葉下珠復(fù)方中劑量組未見大面積灶性壞死，各標(biāo)本仍見肝細(xì)胞濁腫，輕度脂肪變性，小部分血管出現(xiàn)極輕度圍管浸潤(rùn)，可見小面積局灶性壞死，Kupffer細(xì)胞輕度增加；葉下珠復(fù)方大劑量組肝細(xì)胞排列整齊，部

14、分肝組織可見散在點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少。少數(shù)血管出現(xiàn)極輕度圍管浸潤(rùn)，輕度灶性壞死，余未見異常。 5.腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示對(duì)照組腫瘤呈遞增性生長(zhǎng)，而葉下珠復(fù)方治療組和5-Fu組生長(zhǎng)曲線則較為低平，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制。葉下珠復(fù)方治療組抑瘤率為32.5％，5-Fu組為30.8％，均與對(duì)照組有明顯差異(p＜0.05)。裸鼠移植瘤組織的病理學(xué)觀察，瘤組織間有較多粗細(xì)不一的纖維組織將瘤細(xì)胞分隔成巢狀，

15、部分癌細(xì)胞呈梁狀，腺腔狀排列，可見較多發(fā)育不完整的血竇結(jié)構(gòu)，大多數(shù)細(xì)胞呈三角形，胞漿豐富，較多嗜酸性顆粒，胞核大小形態(tài)極不規(guī)則，核漿比例增大，可見較多病理性核分裂象，瘤巨細(xì)胞偶見。葉下珠復(fù)方治療組瘤塊中癌細(xì)胞排列散亂，有大量核固縮或碎裂的表現(xiàn)為凋亡狀態(tài)的細(xì)胞和不同程度壞死；5-Fu組瘤塊內(nèi)有片狀壞死，但細(xì)胞排列較為整齊。 6.葉下珠復(fù)方治療組有p53基因表達(dá)，生理鹽水及5-Fu組均未見p53明顯表達(dá)。對(duì)該表達(dá)的p53基因進(jìn)行克隆

16、和序列測(cè)定，證實(shí)該表達(dá)的p53基因?yàn)橐吧汀ＨM均有不同程度的c-myc基因表達(dá)，以β-acting為內(nèi)參照，分別對(duì)各組所出現(xiàn)的特異性擴(kuò)增條帶進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示：葉下珠復(fù)方治療組c-myc表達(dá)量明顯低于生理鹽水及5-Fu組(p＜0.05)。各組未見p53蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說明葉下珠復(fù)方組表達(dá)的為野生型p53基因。三組均有C-myc蛋白胞漿陽性表達(dá)，葉下珠復(fù)方治療組、5-FU組c-myc蛋白表達(dá)均較陰性對(duì)照組低(P＜0.01)，但葉下

17、珠復(fù)方治療組和5-FU組c-myc蛋白表達(dá)組間無明顯差異(p＞0.05)。 五、結(jié)論1.葉下珠復(fù)方有體外抗HBV作用。 2.葉下珠復(fù)方對(duì)Con-A所致的免疫性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與降低TNF-α和IL-8等介導(dǎo)肝損傷的細(xì)胞因子分泌有關(guān)。 3.葉下珠復(fù)方對(duì)人肝癌HePG2細(xì)胞的體外增殖有抑制作用，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡可能是其機(jī)制之一。 4.葉下珠復(fù)方有體內(nèi)抗腫瘤活性，對(duì)人肝癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)有