柑橘潰瘍病菌的分子鑒定及檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、柑橘潰瘍?。–itrus Bacterial Canker Disease，CBCD）為一種由地毯草黃單胞桿菌柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.citri，Xac）引起的細(xì)菌性病害，該病害對(duì)柑橘生產(chǎn)危害嚴(yán)重，世界許多國(guó)家將其列為重要檢疫性病害。目前，國(guó)內(nèi)外均十分重視該病原菌的鑒定和檢疫檢驗(yàn)技術(shù)研究，在包括分子生物學(xué)鑒定方法在內(nèi)的多種快速檢疫鑒定技術(shù)研究中取得重要進(jìn)展。 本研究對(duì)來(lái)源于湖北的一個(gè)表現(xiàn)

2、柑橘潰瘍病類(lèi)似癥狀的柑橘樣品上的病原菌進(jìn)行了分子鑒定，并從生物學(xué)、PCR和免疫熒光技術(shù)3個(gè)方面對(duì)柑橘潰瘍病菌的快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了研究，取得如下研究結(jié)果： 1．從表現(xiàn)類(lèi)似柑橘潰瘍病的柑橘干葉上共分離到形成4種不同菌落的細(xì)菌。分別對(duì)來(lái)源于南京的陽(yáng)性對(duì)照菌株、病斑研磨液Xo及分離獲得的4個(gè)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中陽(yáng)性對(duì)照菌株和病斑研磨液X0均擴(kuò)增出一條與預(yù)期大小一致的413bp的目標(biāo)片段；而從分離到的X<,4>中擴(kuò)增出大小為500－60

3、0bp的片段；從水稻白葉枯病菌、X<,1>、X<,2>和X<,3>中未擴(kuò)增出任何片段。分別對(duì)以上擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，結(jié)果表明，來(lái)源于南京（NJ-XC）的對(duì)照菌株和湖北病葉研磨液的克隆片段全長(zhǎng)均為413個(gè)核苷酸，與Silva等（2002）報(bào)道的相應(yīng)序列相似性分別為99％（411／413）和100％（413／413）。從分離菌X<,4>中擴(kuò)增出的片段全長(zhǎng)557 bp，GenBank Blast（nr）檢索結(jié)果表明該片段與根癌土壤桿菌（A

4、grobacterium romefaciens）的一個(gè)片段高度相似，部分片段相似性為93％（484／515）。 2．用濃度為10<'3>cfu／ml的柑橘潰瘍病菌培養(yǎng)液針刺法接種7個(gè)柑橘品種離體葉片后，表現(xiàn)出不同的發(fā)病情況。其中福本、紅肉臍、紐荷爾橙、墨西哥萊檬和枳殼發(fā)病均較快，癥狀明顯，而粗檸檬和鄧肯葡萄柚的癥狀表現(xiàn)不明顯，僅出現(xiàn)了黃褐色壞死現(xiàn)象。 3．分別采用氯仿／異戊醇方法提取的DNA和蛋白酶K裂解液作模板進(jìn)行P

5、CR擴(kuò)增，其中以提取的DNA作模板，從來(lái)自南京、四川和湖北的3個(gè)柑橘潰瘍病菌株NJ-XAC、SC-XAC和HB-XAC中均擴(kuò)增出了預(yù)期大小413bp的目標(biāo)片段；直接用裂解液作模板在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從NJ-XAC和SC-XAC中也擴(kuò)出了目標(biāo)片段，但其電泳條帶相對(duì)較弱。 4．用濃度為1×10<'3>cfu／ml的菌液經(jīng)涂片、BSA封閉、抗體結(jié)合和熒光顯微觀(guān)察，結(jié)果顯示，30℃下用BSA封閉2h，30℃下抗體結(jié)合1h，熒光抗