鰻弧菌毒力相關(guān)基因fatA的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、鰻弧菌是海洋魚(yú)類(lèi)弧菌病(一種高致死性的出血性敗血癥)主要病原體之一。本研究通過(guò)分子克隆、基因重組技術(shù)，在體外將鰻弧菌(Vibrioanguillarum)毒力的主要決定因素、同時(shí)也是鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)中的主要成分——外膜蛋白FatA(OM2蛋白)的編碼基因fatA連接到pET-28a(+)表達(dá)載體上，而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，使其表達(dá)外源蛋白FatA(OM2蛋白)，進(jìn)而利用表達(dá)的外源蛋白制備抗原，免疫動(dòng)物，最終得到抗血清，為進(jìn)

2、一步研制鰻弧菌的活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)首先以鰻弧菌菌株MVM425為材料，利用SDS裂解法對(duì)pEIB1質(zhì)粒進(jìn)行提取，并以提取的質(zhì)粒為模版，利用PCR擴(kuò)增得到蛋白FatA的編碼基因fatA，經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切后將其連接入pET-28a(+)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并對(duì)重組子進(jìn)行雙酶切鑒定以及序列測(cè)定。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切，得到兩條片段，片段大小分別對(duì)應(yīng)pET-28a(+)質(zhì)粒以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將

3、重組質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示的堿基序列與文獻(xiàn)中已報(bào)道的堿基序列完全一致。編碼的蛋白質(zhì)為融合蛋白，在該蛋白的C末端引入了6個(gè)組氨酸(His標(biāo)簽)，利于后續(xù)蛋白純化。 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)，用1mM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，并對(duì)蛋白在菌體內(nèi)的表達(dá)形式進(jìn)行分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示，與對(duì)照菌相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌在分子量為86KDa處有蛋白表達(dá)，該蛋白的大小與文獻(xiàn)中已報(bào)道的FatA蛋白的

4、大小一致。進(jìn)一步分析表明，在37℃條件下經(jīng)1mMIPTG誘導(dǎo)3h時(shí)蛋白表達(dá)量最大，并且表達(dá)的蛋白大部分是以包涵體的形式存在的。 用2M尿素對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行初步洗滌后，利用目的蛋白的多聚組氨酸尾巴進(jìn)行親和層析以純化目的蛋白。將純化得到的目的蛋白經(jīng)PBS透析、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒定量后，用30％的PEG8000濃縮至適當(dāng)濃度，制備抗原免疫動(dòng)物，以收獲抗血清，并利用得到的抗血清進(jìn)行瓊脂雙向擴(kuò)散以及蛋白質(zhì)印跡。經(jīng)瓊脂雙向擴(kuò)散測(cè)得抗血

5、清的效價(jià)為1∶128；蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果顯示，在硝酸纖維素膜上特異性的顯示出了分子量為86KDa的蛋白條帶。 綜上所述，重組質(zhì)粒pET-28a(+)/fatA能夠成功地在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出外源蛋白FatA，所獲得的融合蛋白的大小與預(yù)期相同。利用親和層析純化后的該融合蛋白制備抗原，免疫動(dòng)物得到的抗血清的效價(jià)為1∶128。 通過(guò)本課題的實(shí)驗(yàn)，就為今后以外膜蛋白FatA為靶蛋白，將其編碼基因連接到乳酸菌特異的P1