雞NK細(xì)胞C-型凝集素樣受體蛋白BNK19的單抗制備.pdf

1、自然殺傷（Natural killer, NK）細(xì)胞是哺乳動(dòng)物以及其他脊椎動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有抗腫瘤、抗病毒感染的作用。NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能與活化性受體與抑制性受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞有關(guān)。近年來(lái)，雞 NK細(xì)胞的研究也逐漸受到重視，研究的主要困難在于缺乏確定的NK細(xì)胞表面標(biāo)志。b-nk基因編碼的BNK蛋白是表達(dá)于雞NK細(xì)胞表面的C型凝集素樣受體蛋白。BNK是高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白，胞質(zhì)尾區(qū)有一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序，與哺乳

2、動(dòng)物NK細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)相似，因此推測(cè)BNK蛋白是雞NK細(xì)胞的潛在受體。
　　b-nk基因位于雞的主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex, MHC）核心區(qū)域，與MHC-B核心基因緊密連鎖。本研究利用國(guó)家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心保存的MHC單倍型雞BW/G1等6個(gè)品系，包括B19、B21等MHC-B單倍型，根據(jù)NCBI上公布的不同單倍型雞的b-nk基因序列，比較了單倍型雞的b-nk基因多態(tài)性，

3、生物信息學(xué)分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)單倍型序列完全一致，表明可以利用b-nk基因進(jìn)行MHC單倍型雞遺傳穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)，同時(shí)也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)材料。
　　以對(duì)多種疫病有較強(qiáng)敏感性的B19單倍型雞b-nk基因原核表達(dá)蛋白（BNK19）免疫小鼠，建立間接ELISA方法，篩選獲得一株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株7A10，與原核表達(dá)的BNK21沒(méi)有Western Blot反應(yīng)性，具有鑒別意義。截短表達(dá)分析結(jié)果表明，7A10針對(duì)表位在E149-S168之間。<

4、br>　　從B19單倍型雞外周血中分離淋巴細(xì)胞，刀豆素-A刺激后，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增b-nk19基因，插入真核表達(dá)載體pIRES，成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES-BNK19，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系，用G418加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)BNK19的細(xì)胞系。
　　7A10單抗能夠通過(guò)Western Blot檢測(cè)到雞外周血淋巴細(xì)胞中BNK蛋白的表達(dá)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，7A10標(biāo)記細(xì)胞占雞外周血淋巴細(xì)胞的16.7％。本實(shí)驗(yàn)為BN