弓形蟲超氧化物歧化酶(SOD)基金分析和克隆表達.pdf

1、剛地弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，可以感染所有溫血動物，包括人、家畜和海洋哺乳動物，引起人獸共患弓形蟲病。在多數(shù)情況下，人感染弓形蟲后沒有明顯的臨床癥狀，但是當機體免疫低下時，弓形蟲的感染可能會造成嚴重的后果。弓形蟲嚴重威脅著人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，已引起醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)界的高度重視。所以，對弓形蟲與弓形蟲病的研究具有十分重要的意義。
　　超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)廣泛存在于多種生物體內(nèi)，包括

2、植物、動物、微生物等，在醫(yī)學(xué)、食品業(yè)、工業(yè)上有潛在的利用價值。超氧化物歧化酶亦普遍存在于弓形蟲中，以往的研究表明，超氧化物歧化酶可能在弓形蟲的胞內(nèi)生長中發(fā)揮重要作用。
　　方法:分別對十個弓形蟲蟲株SOD基因進行PCR擴增，構(gòu)建相應(yīng)的重組克隆載體pEASY-SOD，經(jīng)DNA測序，獲得不同蟲株來源的SOD基因序列;然后用限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性分析分型法(PCR-RFLP)和生物信息學(xué)的方法對弓形蟲SOD基因序列進行分析。同時，利用分

3、子克隆技術(shù)構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-SOD，經(jīng)PCR、酶切與測序鑒定正確后，體外轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，利用熒光顯微鏡、SDS-PAGE和Western Blotting檢測蛋白表達。
　　結(jié)果:十個不同蟲株來源的弓形蟲SOD基因序列大約1700bp，PCR-RFLP酶切的結(jié)果顯示酶切片段是相同的;DNA測序結(jié)果顯示十個SOD序列之間有43個堿基和24個氨基酸改變，變異度在0到1％之間;系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示10株弓形蟲SOD序

4、列可以大致分為兩組，且各組間存在著很小的差異。上述結(jié)果表明弓形蟲SOD具有高度保守性，可能是弓形蟲DNA疫苗的靶點。另外，重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-SOD構(gòu)建正確，經(jīng)熒光顯微鏡、SDS-PAGE和Westernblotting鑒定，弓形蟲SOD基因可以在HEK293T細胞中瞬時表達，并且具有一定的免疫活性。
　　結(jié)論:弓形蟲SOD基因序列具有高度保守性，可能是弓形蟲DNA疫苗的靶點;成功構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-SOD，