PEDV新疫苗候選株的篩選及其分子特征.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是豬病毒性腹瀉爆發(fā)的主要病原之一，并在世界各地廣泛流行，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。根據(jù)遺傳演化分析結(jié)果，可將PEDV分為G1型和G2型。目前現(xiàn)地流行毒株大部分屬于G2型，經(jīng)典疫苗毒株CV777屬于G1型，盡管經(jīng)典的PEDV弱毒疫苗和滅活苗對PEDV的防控起到了一定作用，但是不能完全有效地控制PEDV的流行。因此，篩選新型的PEDV疫苗候選毒株迫在眉睫。
　　本實(shí)驗(yàn)室于2014年分離到1株P(guān)EDV流行毒

2、株LNCT2株，通過全基因組演化分析表明，該分離毒株與目前國內(nèi)的流行毒株親緣關(guān)系較近，屬于G2型PEDV毒株。通過噬斑純化的方法獲得抗原性單一的克隆毒株，利用血清中和試驗(yàn)測定不同克隆毒株的抗體滴度，篩選到了具有良好免疫原性的克隆毒株。采用體外連續(xù)傳代的方法致弱病毒，并分析不同代次基因組的特征。
　　為了驗(yàn)證低溫傳代對PEDV遺傳演化的影響，采取了常溫傳代(NA)和低溫傳代(CA)兩種方法進(jìn)行病毒的致弱，利用生物信息學(xué)軟件對兩種傳代

3、方式的毒株進(jìn)行全基因組的序列分析。結(jié)果表明，與常溫傳代毒株相比，低溫傳代可以促進(jìn)PEDV的變異。對不同代次的LNCT2毒株全基因組進(jìn)行克隆測序，分析比較其基因序列差異，結(jié)果表明LNCT2毒株在傳代過程中氨基酸的突變率隨著體外傳代代次的增加而增加。為研究溫度對病毒生物學(xué)特性的影響，本研究通過測定兩種傳代溫度下病毒的滴度，發(fā)現(xiàn)病毒滴度隨著代次的增加而升高，30代以后病毒滴度升高更快，兩個克隆株病毒滴度在第100代時均達(dá)到了106 TCID5

4、0/mL以上，表明溫度對病毒滴度影響不大。此外，為了解LNCT2株與經(jīng)典毒株CV777致弱過程中的差異，分析比較LNCT2株第100代(LNCT2-P100)與LNCT2第5代(LNCT2-P5)之間基因組的變異特征，結(jié)果顯示，LNCT2株S蛋白和復(fù)制酶ORF1ab的氨基酸突變數(shù)量最多，且S蛋白出現(xiàn)了5個連續(xù)的氨基酸缺失，第100代未出現(xiàn)ORF3的缺失現(xiàn)象;而經(jīng)典毒株CV777的S蛋白和復(fù)制酶ORF1ab氨基酸突變率明顯比LNCT2高很

5、多，表明兩者在體外傳代致弱過程中氨基酸的突變率存在顯著差異。比較分析不同代次LNCT2-NA與LNCT2-CA的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)N蛋白均沒有發(fā)生突變，而M蛋白雖然出現(xiàn)突變，但突變位點(diǎn)和突變后的氨基酸種類相同，說明PEDVN蛋白與病毒適應(yīng)Vero E6細(xì)胞無關(guān)，且M蛋白對低溫不敏感。
　　為驗(yàn)證LNCT2-P100的毒力是否已經(jīng)減弱，本研究選擇常溫傳代的LNCT2-P100和LNCT2-P10株對1日齡的健康仔豬進(jìn)行感染試驗(yàn)，攻毒劑

6、量為2×104 TCID50/頭，試驗(yàn)結(jié)果顯示，P10攻毒組仔豬均出現(xiàn)劇烈的嘔吐和腹瀉等臨床癥狀，P100攻毒組仔豬未出現(xiàn)異常表現(xiàn)。剖檢各組仔豬發(fā)現(xiàn)P10組仔豬小腸內(nèi)充滿黃色液體，腸壁明顯變薄。組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯示，P10攻毒組仔豬小腸絨毛脫落萎縮，IHC結(jié)果顯示，P10攻毒組病毒主要分布在小腸絨毛的表面，P100和空白對照組仔豬均未檢測到病毒。利用RT-qPCR的方法測定各組仔豬腸道內(nèi)病毒的載量，結(jié)果顯示P10組仔豬小腸各段均能檢測

7、到病毒的核酸，P100組和空白對照組仔豬小腸絨毛完整且沒有檢測到病毒的核酸。
　　總之，本研究通過噬斑克隆、血清抗體中和試驗(yàn)篩選到一株疫苗候選株。通過分析LNCT2毒株在體外傳代過程中全基因組的遺傳演化特征，發(fā)現(xiàn)基因的突變頻率隨著病毒體外傳代次數(shù)的增加而增加。不同代次LNCT2-NA與LNCT2-CA的氨基酸序列分析結(jié)果顯示PEDV N蛋白與病毒適應(yīng)Vero E6細(xì)胞無關(guān)，且M蛋白對低溫不敏感。動物試驗(yàn)結(jié)果表明LNCT2-P100