黃鱔胰蛋白酶的純化及動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、胰蛋白酶是消化酶的一種，屬于絲氨酸蛋白酶家族，對(duì)魚(yú)類(lèi)食物蛋白質(zhì)的消化具有重要的生理作用。胰蛋白酶來(lái)源于魚(yú)類(lèi)的胰臟、腸道和幽門(mén)盲囊。胰蛋白酶是以無(wú)活性的酶原形式存在于魚(yú)類(lèi)胰臟中，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。黃鱔是我國(guó)主要的名優(yōu)淡水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖品種之一，其營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美，進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)殖具有廣闊的發(fā)展前景。黃鱔胰蛋白酶的相關(guān)研究可為黃鱔飼養(yǎng)的飼料配給提供相關(guān)信息，也可為一直作為下腳料的黃鱔

2、內(nèi)臟的合理回收利用提供理論基礎(chǔ)?？墒堑侥壳盀橹?，還未見(jiàn)黃鱔胰蛋白酶分離純化及其性質(zhì)方面的研究報(bào)道。本研究主要是對(duì)黃鱔胰蛋白酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析研究，具體研究如下： 1.黃鱔胰蛋白酶的純化研究將黃鱔在冰盤(pán)上解剖，取出肝胰臟，用預(yù)冷單蒸水淋洗，再用紗布將其瀝干，加入四倍體積的pH8.050mMTris-HCl緩沖液(含0.02﹪疊氮化鈉)中，用攪拌機(jī)打碎成稀糊狀液。4℃靜置過(guò)夜后離心(15000g×40min)

3、，過(guò)濾取上清液。然后將胰蛋白酶粗提液在4℃按飽和度30﹪、40﹪、50﹪、60﹪、70﹪、100﹪逐步進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，確定出胰蛋白酶的最佳硫酸銨沉淀飽和度范圍為30﹪～60﹪。收集30﹪～60﹪的硫酸銨沉淀，用適量的提取液溶解后，在同樣的緩沖液中透析過(guò)夜。 離子交換填料采用Amersham公司的DEAE-SepharoseTMFastFlow，裝入層析柱(1.2×20cm)中，先用大約100ml的50mM、pH7.0Tris

4、-HCl緩沖液以8-10ml/min的速度平衡DEAE-SepharoseTMFastFlow柱，然后將透析過(guò)夜后的酶液上柱子DEAE-sepharoseFastFlow離子交換層析柱，再用相同的緩沖液沖洗掉未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用50mM、pH7.0Tris-HCl緩沖液(含0.1MNaCl、0.2MNaCl、0.3MNaCl、0.4MNaCl、0.5MNaCl)分別進(jìn)行洗脫，收集具有胰蛋白酶活性的洗脫峰，進(jìn)行下一步純化。 親和層析

5、采用的是5mLHiTrapBenzamidineFF(highsub)親和預(yù)裝柱。先用5個(gè)柱床體積(25ml)pH8.00.05MTris-HCl緩沖液(含0.5MNaCl)以2mL/min的流速平衡。待基線(xiàn)為0.02以下時(shí)，然后以2mL/min的流速上樣。再用5-10個(gè)柱床體積的平衡液沖洗，洗去未吸附在親和吸附劑上的雜質(zhì)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，選擇用pH3.050mM甘氨酸-HCl親和洗脫液以5mL/min的速度洗脫，收集具有胰蛋白酶活性的洗脫

6、峰，每毫升加60-200ulpH9.01MTris-HCl調(diào)節(jié)其pH值，以保持酶的穩(wěn)定。 用5﹪的濃縮膠和12﹪的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，黃胰蛋白酶呈現(xiàn)出單一條帶。并測(cè)得胰蛋白酶的分子量約為26.8KDa。通過(guò)測(cè)定每一分離純化步驟所得胰酶樣品的活力及比活力(以TAME為底物)，黃鱔胰蛋白酶的純化倍數(shù)達(dá)到約900倍，比活力為538U/mg，最終產(chǎn)率為14.6﹪。 2.黃鱔胰蛋白酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究以BANPA為底物，

7、測(cè)得黃鱔胰蛋白酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km)為0.22mM。取黃鱔胰蛋白酶純品液，在同一pH值(8.0)條件下，設(shè)20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃等12個(gè)溫度梯度，分別以TAME為底物測(cè)定胰蛋白酶的活性，測(cè)得黃鱔胰蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50℃。在同一溫度(25℃)條件下，設(shè)6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5等10個(gè)pH梯度，分別以TAM

8、E為底物測(cè)胰蛋白酶的活性，測(cè)得黃鱔胰蛋白酶的最適反應(yīng)pH值為8.0。 將黃鱔胰蛋白酶在不同的溫度條件下(30℃、40℃、50℃)放置一段時(shí)間后，其活性都隨著時(shí)間的增加而逐漸減少，其中30℃條件下胰蛋白酶活性減少的趨勢(shì)最慢，50℃條件下胰蛋白酶活性減少的趨勢(shì)最快，40℃條件下胰蛋白酶活性減少的趨勢(shì)居中。將黃鱔胰蛋白酶在不同的pH條件下(6.0、7.0、8.0、9.0)放置一段時(shí)間后，其中pH7.0的條件下胰蛋白酶活性幾乎保持不變，

9、pH9.0條件下胰蛋白酶活性減少的趨勢(shì)較快，pH8.0條件下胰蛋白酶活性減少的趨勢(shì)較慢，pH6.0條件下胰蛋白酶活性減少的趨勢(shì)最快。 在黃鱔胰蛋白酶液中分別加入不同濃度(5mM、10mM、15mM、20mM)的金屬離子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+)和EDTA溶液，分別處理30min后。結(jié)果顯示，Na+、Ca2+對(duì)黃鱔胰蛋白酶的活性并無(wú)影響；Mg2+對(duì)黃鱔胰蛋白酶的活性有輕微的抑制作用；Cu2+和EDTA對(duì)黃鱔胰蛋