鍶對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)炎性骨溶解抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分:鍶離子在鈦顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化中的作用
　　目的：觀察鍶離子(strontium,Sr2+)對(duì)鈦顆粒(titanium particles,Ti)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化的影響。
　　方法：選用小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞作為研究對(duì)象,采用核因子(NF-κB)受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factorкB ligand,RA

2、NKL RANKL;70ng/ml)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF;30ng/ml)誘導(dǎo)RAW264.7向破骨細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)分為5組:僅RAW264.7細(xì)胞,為空白組;RAW264.7+Ti,為T(mén)i組;RAW264.7+RANKL+M-CSF,為R組;RAW264.7+RANKL+M-CSF+Ti,為R+Ti組;在R+Ti組的基礎(chǔ)上加入不同濃度Sr2+(0.5

3、、1、2、5、10mmol/L),為Sr2+組。采用細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)檢測(cè)0.1g/L Ti和不同濃度Sr2+處理RAW264.7細(xì)胞24、48、72h后的細(xì)胞增殖活性;應(yīng)用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色檢測(cè)各組中破骨細(xì)胞(細(xì)胞核≧3)數(shù)目;采用骨細(xì)胞培養(yǎng)表面(OAS)板檢測(cè)破骨細(xì)胞骨吸收能力;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)組織

4、蛋白酶K(cathepsin K,Cath-K)、TRAP、金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase9,MMP-9)、降鈣素受體(calcitonin receptor,CTR)基因mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明,0.1g/L Ti顆粒和不同濃度Sr2+(0.5、1、2、5、10mmol/L)對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯影響(P>0.05)。TRAP染色,R組、R+Ti組均可見(jiàn)大

5、量的紫紅色多核細(xì)胞,Ti組和Sr2+組多核細(xì)胞較少,空白組未見(jiàn)多核細(xì)胞;Sr2+≥5mmol/L時(shí),TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量[(323.33±43.84)、(146.67±33.99)]個(gè)/孔,與R組[(453.33±33.99)個(gè)/孔]比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OAS板檢測(cè)結(jié)果,5mmol/LSr2+組骨吸收陷窩面積比(6.53±2.02)％,與R+Ti組[(47.24±5.03)％]比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

6、定量RT-PCR結(jié)果,Sr2+組Cath-K、TRAP、MMP-9和CTRmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.76±0.66、2.69±0.57、2.10±0.34和1.72±0.32,與R+Ti組比較(7.97±0.77、10.10±1.18、7.37±1.02和5.55±0.53),表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：Sr2+能夠抑制Ti誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的生成,抑制Ti誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞表型基因Cath-K、TRAP、MMP-9和C

7、TR mRNA的表達(dá),減輕Ti活化的破骨細(xì)胞性骨吸收,提示Sr2+能夠抑制Ti顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化。
　　第二部分:鍶離子抑制鈦顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化作用的機(jī)制研究
　　目的：探討鍶離子(Sr2+)在抑制鈦顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化過(guò)程中,對(duì)細(xì)胞核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號(hào)途徑及炎性因子表達(dá)的影響。
　　方法：選用小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)分為3

8、組:僅RAW264.7細(xì)胞,為空白組;RAW264.7+Ti,為T(mén)i組;RAW264.7+Ti+5mmol/L Sr2+,為T(mén)i+Sr2+組。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)c-fos和激活T細(xì)胞的核因子c1(nuclear factor of activated T-cells c1,NFATc1)基因mRNA的表達(dá)。蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)κB抑制蛋白α(inhibitoryκBα,IκBα)蛋白表達(dá)水

9、平;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)炎性因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、(interleukin-1β,IL-1β)及(interleukin-6,IL-6)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果表明,Ti(0.1g/L)加入后15min,IκBα表達(dá)水平明顯降低,60min降至最低,180min后IκBα又恢復(fù)到基準(zhǔn)水平。以5mmol/L Sr2+預(yù)處理120min,再加入Ti

10、顆粒處理15、30和60min,IκBα表達(dá)水平變化不明顯。RT-PCR結(jié)果提示,Ti加入后1h,NFATc1表達(dá)量達(dá)到最高水平,3h開(kāi)始降低,6h降低基準(zhǔn)水平; Ti加入1h后,c-fos表達(dá)量明顯增高,3h達(dá)到最高水平,6h表達(dá)量降低,但仍高于基準(zhǔn)值。Sr2+預(yù)處理細(xì)胞120min,再與Ti共培養(yǎng)6h,兩基因表達(dá)量與Ti組比較均明顯降低。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,共培養(yǎng)48h后,空白組上清液中TNF-α,IL-1β和IL-6分別為(5

11、4.8±7.3)pg/ml、(113.6±9.6)pg/ml和(41.6±7.0)pg/ml, Ti+Sr2+組[(153.0±14.3)、(203.2±13.5)、(101.4±9.1)],與Ti組[(309.6±20.0)、(257.6±14.3)、(164.4±13.1)] pg/ml比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：Sr2+通過(guò)干擾NF-κB信號(hào)途徑和降低炎性因子TNF-α,IL-1β和IL-6表達(dá)水平,

12、抑制Ti顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化。
　　第三部分:雷尼酸鍶抑制鈦顆粒誘導(dǎo)炎性骨溶解的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：觀察雷尼酸鍶(strontium ranelate,SR)在鈦顆粒(Ti)誘導(dǎo)炎性骨溶解中的作用。
　　方法：60只雄性,8-10周齡,C57BL/J6小鼠,隨機(jī)分為空白組、SR組、Ti組、和Ti+SR組,每組15只。采用Ti誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解模型,Ti+SR組建模當(dāng)日予SR(900mg/kg/d)灌胃,持續(xù)至建模后

13、14天,處死小鼠取材。微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro-CT)分析顱骨骨密度及骨量變化;HE染色觀察顱骨骨溶解程度;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測(cè)顱骨中成熟破骨細(xì)胞數(shù)目;免疫組織化學(xué)染色(IHS)檢測(cè)核因子受體活化因子(receptor activators of nuclear factor-kappa B,RANK)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)水平,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)骨保護(hù)素(osteoprotege

14、rin,OPG)、核因子受體活化因子受體(RANKL)、TNF-α和白介素-1β(IL-1β)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Micro-CT3D分析結(jié)果提示,Ti組顱骨骨陷窩范圍廣,深度大,Ti+SR組顱骨骨陷窩量明顯下降,空白組顱骨骨密度(bone minaral density,BMD)、骨體積(bone volume,BV)和骨體積/組織體積(bone volume/tissue volume,BV/TV)分別為(0.77±0.02

15、)mg/mm2、(1.55±0.03)mm3和(23.12±0.93),Ti+SR組為[(0.73±0.03) mg/mm2、(1.50±0.03)mm3、(21.97±0.55)％],與Ti組[(0.62±0.03)mg/mm2、(1.22±0.07)mm3、(16.05±0.63)％]比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); HE染色結(jié)果顯示,空白組及SR組未見(jiàn)明顯骨溶解,Ti組顱骨溶解區(qū)域廣、深度大,Ti+SR組骨溶解程度明顯減輕

16、,Ti+SR組顱骨面積比(87.67±4.63)％,與Ti組[(56.83±7.19)％]比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);TRAP染色結(jié)果,空白組及SR組可見(jiàn)點(diǎn)狀的紫紅色陽(yáng)性改變,且主要集中于髓腔邊緣;Ti組顱骨溶解側(cè)可見(jiàn)大片紫紅色區(qū)域,表明顱骨溶解側(cè)有大量的破骨細(xì)胞存在,Ti+SR組僅在在顱骨溶解邊緣有少量陽(yáng)性區(qū)域;IHS染色結(jié)果,Ti組RANK和TNF-α棕黃色陽(yáng)性區(qū)域,與空白組比較明顯增多, SR干預(yù)后陽(yáng)性區(qū)域明顯降低;E

17、LISA檢測(cè)結(jié)果顯示,空白組顱骨培養(yǎng)上清液中OPG、RANKL、TNF-α和IL-1β的含量分別為(2144±81)pg/ml、(11.8±0.8)pg/ml、(101.2±7.3)pg/ml和(97.0±9.9)pg/ml,Ti+SR組為[(2050±42)、(13.0±1.0)、(145.6±14.2)和(130.2±8.2)]pg/ml,與Ti組[(1636±61)、(19.6±1.8)、(210.2±8.9)和(159.6±9.