觀賞向日葵NBS類抗病基因類似物的克隆與分析.pdf

1、向日葵(Helianthus annuus)可供油用及食用，亦為觀賞或維護(hù)生態(tài)景觀之最佳作物。向日葵感染病害對(duì)其產(chǎn)量、質(zhì)量和觀賞效果都會(huì)產(chǎn)生很大的影響。目前，對(duì)于植物病害的防治通常采用抗病品種及農(nóng)藥防治相結(jié)合的方法，但許多植物品種往往只具有單一抗性，而農(nóng)藥防治對(duì)人類的健康和生活環(huán)境卻存有著巨大的潛在威脅。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行植物品種的改良已被應(yīng)用到農(nóng)作物的生產(chǎn)中，因此植物抗病基因的克隆對(duì)于抗病遺傳育種及抗病機(jī)制的深

2、入研究具有重要的意義。 本論文的研究?jī)?nèi)容包括：(1)根據(jù)已知植物抗病基因NBS區(qū)的保守氨基酸結(jié)構(gòu)域(P-loop和GLPL)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以抗病性好的觀賞向日葵品種“Valentine”(淺黃色舌狀花，深紫色管狀花)的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增其NBS類抗病基因類似物(Resistance gene analogs，RGAs)，并對(duì)RGAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，揭示觀賞向日葵抗病基因的多樣性及進(jìn)化關(guān)系；(2)利用獲得的觀賞向目

3、葵RGAs設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)所收集的觀賞向日葵及油葵品種進(jìn)行特異性比較分析；(3)對(duì)獲得的觀賞向日葵SFRGA-3片段進(jìn)行Southern雜交分析。主要研究結(jié)果如下： 1.從觀賞向日葵品種“Valentine”基因組DNA中擴(kuò)增出24條具有連續(xù)開(kāi)放閱讀框(ORF)的RGAs，分別命名為：SFRGA1～SFRGA24，登陸號(hào)：EU352826～EU352849。序列分析結(jié)果表明；24條RGAs編碼的氨基酸均含有典型NBS-LRR類抗

4、病基因所擁有的保守結(jié)構(gòu)域P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水結(jié)構(gòu)域(HD)。同源性搜索表明，其中9條序列與向日葵屬上已克隆的抗病類似蛋白有很高的同源性，其它15條序列搜索出某些植物上已克隆的抗病基因及許多得分較高的抗病類似蛋白序列，其中包含有很多未知基因。24個(gè)RGA核苷酸序列間的相似性在41.1％～99.6％之間變化，氨基酸序列間的相似性在25.8％～100％間變化。對(duì)分離到的RGAs進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，無(wú)論是核

5、苷酸序列還是氨基酸序列都明顯地分為TIR-NBS-LRR和nonTIR-NBS-LRR兩類。 2. 利用獲得的RGA設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，其中RGA8-F1與RGA8-R1、RGA16-F1與RGA16-R1能夠在各向日葵品種基因組DNA中擴(kuò)增出與對(duì)照相應(yīng)大小的片段；而RGA3-F1與RGA3-R1則未在觀賞向日葵品種Sonja中擴(kuò)增出條帶來(lái)，可能缺失了SFRGA3片段，也可能是該品種的SFRGA3片段中已有部分核苷酸序列發(fā)生了