胰島素誘導基因（Insig2）在調(diào)控脂肪細胞分化與脂肪合成中作用的研究.pdf

1、第一部分葡萄糖濃度對3T3-L1細胞分化及insig-1和-2 mRNA表達的影響。 目的:胰島素誘導基因(insig)是近年來發(fā)現(xiàn)的新基因，在脂質(zhì)合成與脂肪細胞的分化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。觀察不同葡萄糖濃度對3T3-L1細胞分化及insig-1，-2 mRNA表達的影響，探討insig在脂肪細胞分化與脂肪代謝中的作用。 方法:將3T3-L1 細胞分別在不同葡萄糖濃度(5.5mol/L和25mol/L)培養(yǎng)液中誘導分化

2、，用紅“O”染色、RT-PCR和原位雜交技術檢測脂肪細胞的分化、insig-1，-2 mRNA 及脂肪細胞脂肪酸結(jié)合蛋白(AP<,2>)mRNA的表達。 結(jié)果：隨著 3T3-L1 細胞的分化，insig-1，-2 mRNA、AP<,2> mRNA 表達逐漸上調(diào)；但低糖誘導組的細胞分化程度顯著低于高糖誘導組；低糖誘導組的insig-1，-2 mRNA 表達較高糖誘導組明顯增高(P<0.05)，而AP<,2>mRNA表達較高糖誘導組

3、明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論:在3T3-L1 細胞分化過程心中，insig基因表達逐漸上調(diào)，低糖時insig的表達上調(diào)更明顯，此可能與低糖時脂肪細胞分化及脂質(zhì)沉積相對受抑制有關。 第二部分insig-2過表達對3T3-L1前脂肪細胞分化與相關基因的影響。 第一章 EGFP-C<,3>-insig-2和pcDNA3.1(+)-insig-2真核表達質(zhì)粒的構建及insig-2的亞細胞定位。 目的:構建 E

4、GFP-C3-insig-2 和 pcDNA3.1(+)-insig-2融合基因真核表達質(zhì)粒，探討insig-2基因的亞細胞定位與表達，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 3T3-L1 細胞insig-2過表達對前脂肪細胞分化的影響。 方法:采用RT-PCR法從3T3-L1細胞獲取小鼠的全長insig-2基因，經(jīng)T載體克隆、鑒定后，分別克隆入真核表達載體 pEGFP-C<,3>及pcDNA3.1(+)中。酶切、測序?qū)Σ迦肫芜M行分析和鑒定后，用脂質(zhì)

5、體轉(zhuǎn)染法將帶綠色熒光蛋白的真核表達載體pEGFP-C<,3>瞬時轉(zhuǎn)入3T3-L1細胞，-通過熒光顯微鏡、RT-PCR檢測其在3T3-L1細胞中的表達、定位及下游基因AP<2> mRNA的變化。 結(jié)果：酶切、測序鑒定所插入片段的大小和基因序列準確無誤，成功構建了重組質(zhì)粒pEGFP-C<,3>-insig-2 和 pCDNA3.1(+)-insig-2 融合基因真核表達載體。pEGFP-C<,3>-insig-2真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染

6、3T3-L1細胞后，該融合蛋白在轉(zhuǎn)染的細胞胞漿中表達；insig-2基因的轉(zhuǎn)錄明顯增強，而其下游基因AP2 mRNA表達明顯下調(diào)。 結(jié)論：insig-2 蛋白在3T3-L1 細胞中定位于胞漿，過表達時影響其脂肪代謝。 第二章 insig-2 基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對3T3-L1細胞分化和脂質(zhì)合成的影響。 目的：研究pCDNA3.1(+)-insig-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞后insig-2基因過表達在3T3-L1脂肪細胞

7、分化和脂肪形成中的作用。 方法：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒 pCDNA3.1(+)-insig-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞。轉(zhuǎn)染后，分別用流式細胞儀檢測pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染組、pCDNA3.1(+)空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染的3T3-L1細胞(空白對照組)的細胞周期與凋亡率；用油紅“O”染色鑒定分析細胞的誘導分化；用半定量RT-PCR測定各組3T3-L1前脂肪細胞及分化過程中insig-2、insig-1、固醇調(diào)節(jié)元件

8、結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins SREBPs)、SREBP 裂解活性蛋白(cleavage-activating protein SCAP)、脂肪酸合成酶(FAS)、AP2基因的mRNA表達；用免疫組織化學法檢測細胞轉(zhuǎn)染后的insig-2蛋白表達。 結(jié)果：半定量RT-PCR檢測和免疫組化分析結(jié)果顯示，insig-2 mRNA及蛋白表達較轉(zhuǎn)染前及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對照

9、組均顯著增加，提示pCDNA3.1(+)-insig-2成功轉(zhuǎn)染的3T3-L1細胞呈高效表達，但對其前體細胞的細胞周期及凋亡率無明顯影響；誘導分化后的第6和12天，pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染組的成熟脂肪細胞明顯少于兩個對照組，且分化過程中三組細胞生長曲線無明顯差異。轉(zhuǎn)染后的3T3-L1前脂肪細胞insig-2相關基因insig-1、FAS、AP2、SREBP1c mRNA均表達下調(diào)；隨著細胞的分化，上述基因mRNA表達均

10、上調(diào)，但pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染組的insig-2較其他兩個對照組顯著上調(diào)，而FAS和AP2 mRNA明顯下調(diào)。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染后insig-2高表達抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化及脂質(zhì)合成相關基因表達。 第三章 insig-2基因過表達對3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素表達的影響。 目的：脂聯(lián)素對糖代謝、脂代謝和能量平衡的調(diào)控有重要作用。觀察pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染后3T3-L1前脂

11、肪細胞脂聯(lián)素mRNA表達及其分化過程中的脂聯(lián)素分泌，探討insig基因過表達對脂肪細胞脂聯(lián)素分泌的影響。 方法：以轉(zhuǎn)染 pCDNA3.1(+)及未轉(zhuǎn)染的3T3-L1細胞為對照組，半定量RT-PCR檢測pCDNA3.1(+)-insig-2轉(zhuǎn)染后24 h和72h 3T3-L1前脂肪細胞的脂聯(lián)素mRNA表達。用ELISA法測定轉(zhuǎn)染后3T3-L1前脂肪細胞及其在誘導分化過程中的脂聯(lián)素動態(tài)變化。 結(jié)果：3T3-L1前脂肪細胞pC