尼古丁通過PI3K-Akt信號通路保護(hù)大鼠軟骨細(xì)胞抵抗白介素-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:探索尼古丁對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠OA軟骨細(xì)胞(模擬OA軟骨細(xì)胞)的調(diào)節(jié)作用,觀察是否能夠通過激活軟骨細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路而抑制OA軟骨細(xì)胞調(diào)亡、維持其存活;同時(shí)結(jié)合大鼠OA動物模型檢測尼古丁對OA軟骨組織損傷的影響,為將來臨床上應(yīng)用尼古丁預(yù)防與治療OA的可能機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 方法:體外實(shí)驗(yàn):(1)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng):從新生大鼠關(guān)節(jié)軟骨中分離出軟骨細(xì)胞,使用特殊染色及免疫組化對其進(jìn)行鑒定,并使其與軟骨細(xì)胞凋亡

2、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)劑IL-1β(10ng/ml)共培養(yǎng)2小時(shí),模擬體外OA軟骨細(xì)胞。(2)軟骨細(xì)胞生存能力檢測:經(jīng)尼古丁處理后,四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測軟骨細(xì)胞活性。(3)軟骨細(xì)胞凋亡率檢測:采用流式細(xì)胞儀熒光素碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)單標(biāo)法檢測軟骨細(xì)胞晚期凋亡率。(4)PI3K/Akt通路及相關(guān)信號分子的檢測:蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測Akt,p-Akt及其下游信號分子b

3、cl-xl、bcl-2和p70S6,核糖體S6激酶的蛋白分泌水平;反轉(zhuǎn)錄RCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)檢測Akt1-mRNA的表達(dá)水平。體內(nèi)試驗(yàn):(1)大鼠膝關(guān)節(jié)動物模型建立:通過右膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切除+內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)構(gòu)建大鼠骨性關(guān)節(jié)炎(OA)模型。(2)尼古丁對大鼠骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨作用觀察:關(guān)節(jié)腔注射尼古丁,組織學(xué)與免疫組化技術(shù)評估大鼠骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)

4、結(jié)構(gòu)變化及與PI3K/Akt信號通路相互關(guān)系。
　　 結(jié)果:(1)體外實(shí)驗(yàn):經(jīng)分離的細(xì)胞甲苯胺藍(lán)著色胞漿染成淺藍(lán)色,可見1-3個(gè)核仁,呈紫藍(lán)色;細(xì)胞周圍亦有少量異染顆粒出現(xiàn),Ⅱ型膠原呈強(qiáng)陽性表達(dá),細(xì)胞漿內(nèi)有黃染顆粒,胞核基本無著色;尼古丁可刺激由IL-1β誘導(dǎo)的大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的活性而抑制其凋亡。對大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞處以尼古丁可上調(diào)p-Akt蛋白表達(dá)水平,但卻未能提高Akt1-mRNA的表達(dá)水平。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)檢測到尼古

5、丁可增強(qiáng)部分Akt下游分子:p70S6、核糖體S6激酶、bcl-xl、bcl-2、TMP-1的表達(dá),但是卻抑制了MMP-13的表達(dá)。(2)體內(nèi)試驗(yàn):大鼠骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腔注射尼古丁促進(jìn)損傷軟骨表面的修復(fù),增加了表面軟骨的厚度,同時(shí)提高了p-Akt的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:尼古丁可部分通過激活PI3K/Akt信號通路保護(hù)由IL-1β誘導(dǎo)的大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡;同時(shí)減緩骨性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨組織的損傷。為此,尼古丁通