第一部分顳葉癲癇的遺傳易感性研究;第二部分發(fā)作性運(yùn)動(dòng)源性手足舞蹈徐動(dòng)癥致病基因突變篩查.pdf

1、第一部分，顳葉癲癇的遺傳易感性研究
　　 研究背景
　　 癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)病及多發(fā)病之一，以反復(fù)自發(fā)地癲癇發(fā)作為特征，引起一系列軀體及社會(huì)心理問(wèn)題。其中，顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)是局灶性癲癇中最常見(jiàn)的類型，也是難治性癲癇中最常見(jiàn)的綜合征類型。TLE作為一種復(fù)雜性疾病，受環(huán)境與遺傳因素的共同影響。遺傳變異通過(guò)影響癇樣放電的易感性、臨床內(nèi)表型特異性及抗癲癇藥物的反應(yīng)性及耐藥性等

2、多個(gè)方面在TLE發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要的作用。候選基因關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了某些神經(jīng)系統(tǒng)特異基因上的常見(jiàn)變異與TLE的發(fā)生相關(guān)，但研究結(jié)果不盡一致。本文應(yīng)用病例對(duì)照的研究方法，以5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter,5-HTT)基因、大電導(dǎo)鈣離子激活鉀離子通道M亞家族β4亞基(potassium large conductance calcium-activated channel，subfamily M，betam

3、emeber,KCNMB4)基因、肉堿/γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(betaine/GABA transporter-1，BGT-1 or SLC6A12)基因、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor,BDNF)基因?yàn)楹蜻x基因，分析基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群TLE的相關(guān)性，并對(duì)部分陽(yáng)性位點(diǎn)在mRNA、蛋白水平及腦影像學(xué)三個(gè)方面進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　 研究方法
　　 以中國(guó)漢族人群TLE患者

4、和非癲癇對(duì)照受試者為研究對(duì)象，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法、TaqMan(R)法檢測(cè)5-HTT、KCNMB4、SLC6A12及BDNF基因上常見(jiàn)多態(tài)性。分析這些位點(diǎn)及構(gòu)成的單倍型與TLE的相關(guān)性，并探討基因型-表型關(guān)系。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)法檢

5、測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)對(duì)外周血單核細(xì)胞SLC6A12基因表達(dá)的影響。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)對(duì)血漿BDNF含量的影響。應(yīng)用頭顱核磁共振（MRI）體素形態(tài)學(xué)分析(voxel-based morphometry，VBM)法檢測(cè)BDNF上陽(yáng)性位點(diǎn)對(duì)海馬體積及海馬對(duì)稱性的影響。
　　 研究結(jié)果
　　 1、5-HTT基因多態(tài)性與TLE的相關(guān)性
　　

6、 在334例TLE患者和487例非癲癇對(duì)照受試者中，檢測(cè)5-HTT基因功能區(qū)的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(5-HTTLPR，rs25531,5-HTTVNTR)，發(fā)現(xiàn)5-HTTVNTR位點(diǎn)的10次重復(fù)等位基因在TLE組的頻率高于對(duì)照組頻率(9.1％vs．6.1%，P=0.0187，OR=1.55，95%CI=1.07-2.26)。
　　 2、KCNMB4基因多態(tài)性與TLE的相關(guān)性
　　 在358例TLE患者和496例非癲癇對(duì)照受試

7、者中，對(duì)KCNMB4基因上的4個(gè)標(biāo)簽SNPs(rs710665，rs11178214，rs9634299，rs7301967)進(jìn)行分型。單位點(diǎn)分析未發(fā)現(xiàn)與TLE關(guān)聯(lián)的SNP。這四個(gè)位點(diǎn)組成的單倍型C-C-G-T在TLE組的頻率低于對(duì)照組頻率(28.5%vs.33.6%，P=0.0258，OR=0.79，95%CI=0.64-0.98)，P值經(jīng)Bonferroni多重比較校正后統(tǒng)計(jì)學(xué)差異消失。TLE按是否合并海馬硬化進(jìn)行分組，rs7301

8、967-C等位基因在TLE伴有海馬硬化亞組的頻率高于非癲癇正常受試者(53.6%vs.45.2%,P=0.041,OR=1.41.95%CI=1.01-1.95).
　　 3、SLC6A12基因多態(tài)性與TLE的相關(guān)性
　　 在358例TLE患者和496例非癲癇對(duì)照受試者中，對(duì)SLC6A12基因上的4個(gè)標(biāo)簽SNPs(rs542736，rs2284329，rs216243，rs9783494)和1個(gè)功能區(qū)SNP(rs5578

9、81)進(jìn)行分型。單位點(diǎn)分析未發(fā)現(xiàn)與TLE關(guān)聯(lián)的SNP。單倍型分析提示rs542736位點(diǎn)與rs557881位點(diǎn)之間的聯(lián)合作用與TLE相關(guān)，即在rs557881的AA基因型攜帶者中，rs542736的G等位基因與TLE及熱性驚厥相關(guān)(P=6.6×10-5，0.012)，并可影響SLC6A12基因表達(dá)(P=1.08×10-8)，而在rs557881的GG基因攜帶者中rs542736的G等位基因的作用消失。
　　 4、BDNF基因多態(tài)

10、性與TLE的相關(guān)性
　　 在360例TLE患者和501例非癲癇對(duì)照受試者中，BDNF基因的功能位點(diǎn)rs6265-A等位基因在TLE組的頻率顯著低于對(duì)照組頻率(42.8%vs.49.6%，P=0.005，OR=0.76，95%CI=0.63-0.92)。臨床表型分析發(fā)現(xiàn)rs6265與熱性驚厥及海馬硬化的發(fā)生相關(guān)(P=0.003，0.029)。
　　 在17例TLE患者和101例對(duì)照中分析血漿BDNF分泌水平，結(jié)果顯示TLE

11、組血漿BDNF水平顯著高于對(duì)照組（P=4.71×10-7），但未發(fā)現(xiàn)rs6265不周基因型間血漿BNDF分泌水平存在差異。
　　 在12例伴有海馬硬化TLE患者、17例不伴有單側(cè)海馬硬化TLE患者和29例對(duì)照中進(jìn)行海馬體積的測(cè)定，比較海馬非對(duì)稱性指數(shù)，結(jié)果表明海馬硬化患者存在明顯的海馬對(duì)稱性降低(P=2.85×10-5)，但未發(fā)現(xiàn)rs6265對(duì)海馬對(duì)稱性的影響。
　　 研究結(jié)論
　　 本研究提示5-HTT、SLC

12、6A12、BDNF基因是中國(guó)漢族人群TLE的易感基因；而KCNMB4基因?qū)LE的易感性貢獻(xiàn)較小。
　　 第二部分，發(fā)作性運(yùn)動(dòng)源性手足舞蹈徐動(dòng)癥致病基因突變篩查
　　 研究背景
　　 發(fā)作性運(yùn)動(dòng)源性手足舞蹈徐動(dòng)癥(paroxysmal kinesigenic choreoathetosis，PKC)是一種罕見(jiàn)的發(fā)作性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有突然動(dòng)作誘發(fā)、發(fā)作期間意識(shí)清醒等特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的肌張力障礙、舞蹈手足徐

13、動(dòng)等不自主運(yùn)動(dòng)，多為常染色體顯性遺傳。本實(shí)驗(yàn)室前期收集了4個(gè)PKC家系，將致病基因定位在16號(hào)染色體著絲粒附近(16p11.2-q12.1)。此區(qū)域?yàn)镻KC的熱點(diǎn)區(qū)域，但致病基因仍未被發(fā)現(xiàn)。新一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)具有高通量快速準(zhǔn)確測(cè)序的特點(diǎn)，已成為識(shí)別遺傳性疾病致病突變的有效手段。本研究利用NGS技術(shù)篩查PKC的致病基因。
　　 研究方法
　　 從前期收集的4個(gè)家系

14、中選擇5例PKC患者和1例正常對(duì)照（未攜帶風(fēng)險(xiǎn)單倍型），應(yīng)用NimbleGen目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片富集定位區(qū)域30Mb序列，并通過(guò)Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。隨后，應(yīng)用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證NGS結(jié)果，并對(duì)29例PKC散發(fā)患者進(jìn)行突變篩查。
　　 研究結(jié)果
　　 利用NGS技術(shù)，每位家系患者中發(fā)現(xiàn)55個(gè)基因上的149～160種非同義變異、選擇性剪接變異及編碼區(qū)插入/缺失變異(NS/SS/I)。通過(guò)與d

15、bSNP129數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)及1例正常對(duì)照的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾后，在2個(gè)家系中鑒定出富含脯氨酸跨膜蛋白2基因（proline-rich transmembrane protein 2，PRRT2）上2個(gè)雜合插入移碼突變(c.369dupG and c.649dupC)，引起氨基酸肽鏈截短(p.S124VfsX10 and p.R217PfsX8)。
　　 Sanger法測(cè)序驗(yàn)證了以上結(jié)果并在1個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)PRRT2基